主题：【分享】啤酒花中1个新的查耳酮类化合物

啤酒花Humulus lupulus L.别名忽布、酒花、蛇麻花、香蛇麻、唐草花、陀得花等，为大麻科葎草属多年生攀援草本植物。啤酒花原产于欧洲，在我国新疆北部有野生分布，东北、华北、西北和山东等地多有栽培[1]，亚洲北部和东北部、美洲东部亦有分布[2]。啤酒花是一种使用历史悠久的药食两用植物，历代本草均有记载，明代李时珍《本草纲目》所引宋代《开宝本草》所记载陀得花即为啤酒花，其志曰：“主一切风血，浸酒服。生西域，胡人将来，胡人采此花以酿酒，呼为三勒浆”。啤酒花用于啤酒酿造具有增加风味、防腐抑菌的作用[3]。除了用于啤酒酿造，啤酒花常以未成熟带花果穗用药，其味苦，性平，具有健胃消食、安神利尿、止咳化痰的功效，常用于治疗消化不良、腹胀、食欲不振、肺结核、膀胱炎、胸膜炎、神经衰弱、失眠等症[4]。啤酒花的化学成分主要包括间苯三酚衍生物类、挥发油类、黄酮类等[5-6]。现代药理学研究表明啤酒花在抗炎、神经保护、抗菌、抗肿瘤、降糖等方面有较好的活性[7-11]。
为进一步阐明啤酒花的药效物质，本研究运用多种色谱分离技术对啤酒花乙醇提取物的二氯甲烷萃取部位进行分离纯化，从中分离得到6个化合物（图1）。运用高分辨质谱、核磁共振等波谱学技术，化合物分别鉴定为2′,4,-二羟基-4′,6′-二甲氧基-3′-(2-羟基-3-甲基-3-丁烯基) 查耳酮 [2′,4′-dihydroxy-4′,6′-dimethoxy-3′-(2-hydroxy-3-methyl-3-butenyl) chalcone，1]、tsugafolin（2）、dihydroxanthohumol（3）、4′-O-methylxanthohumol（4）、(2S,2′′S)-4′-hydroxy-5- methoxy-7,8-(2,2-dimethyl-3-hydroxy-2,3-dihydro-4H-pyrano) flavanone（5）和 (2R,2′′S)-4′-hydroxy-5-methoxy-7,8-(2,2-dimethyl-3-hydroxy-2,3-dihydro-4H-pyrano) flavanone（6）。其中化合物1为1个新的查耳酮类化合物，命名为 (±)-蛇麻花素A；化合物2为首次从葎草属中分离得到，化合物5和6为1对C-2差向异构体。体外抗炎活性实验表明，化合物1和4可以有效抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠RAW264.7细胞释放NO炎性因子，其半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）分别为（5.83±1.76）和（10.45±2.36）μmol/L。

1 仪器与材料
Bruker AV-400/600型核磁共振仪（瑞士Bruker Biospin公司）；傅里叶变换红外/拉曼光谱仪（德国Bruker公司）；分析高效液相色谱仪（Agilent 1260型，DAD检测器，美国Agilent公司）；制备高效液相色谱仪（泵LC-20A，检测器SPD-20A，日本岛津公司）；EYELA旋转蒸发仪（日本东京理化公司）；CP225D型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；SpectraMax i3X型酶标仪（美国Molecular Devices公司）；移液器（德国Eppendorf公司）；二氧化碳细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；BIOFUGE STRATOS型离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；IX73型倒置电子显微镜（日本Olympus公司）。
柱色谱硅胶（100～200、200～300目，青岛海洋化工厂）；硅胶GF254薄层预制板（烟台化学工业研究所）；十八烷基硅烷（ODS，30～50 μm，日本YMC公司）；Sephadex LH-20型凝胶（瑞典Pharmacia公司）；半制备型HPLC色谱柱为Caprisil C18-P色谱柱（250 mm×10 mm，5 μm）；分析型HPLC色谱柱为Caprisil C18-P色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Chiralpak AD-H手性色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；96孔板（美国Coster公司）。一氧化氮检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；RAW264.7细胞（中国医学科学院基础研究所）；LPS（美国Sigma公司）；DMEM培养基、PBS缓冲液及胎牛血清（FBS）均购自美国Gibco公司；DMSO（美国Sigma公司），地塞米松（上海源叶生物有限公司）。实验所用试剂均为分析纯（北京化工厂）和色谱纯（美国Honeywell公司）。
本研究所用啤酒花药材于2021年3月购自新疆维吾尔自治区昌吉市，由中日友好医院药学部马秉智副主任药师鉴定为大麻科葎草属啤酒花H. lupulusL.的带花果穗，样本（20210324）存放于中日友好医院临床医学研究所。
2 提取与分离
取干燥的啤酒花药材（101.4 kg）乙醇浸渍提取3次（300 L×3，每次24 h）。收集合并浸提液（800 L），75 ℃下乙醇加热回流提取2次（700 L×2，每次1 h）。合并提取液，减压浓缩得总浸膏30 L。加入30 L蒸馏水将总浸膏制成混悬液，依次用2倍量的石油醚、二氯甲烷和醋酸乙酯各萃取3次，萃取液减压浓缩得到石油醚部位（49.8 g）、二氯甲烷部位（13.7 kg）和醋酸乙酯部位（202.8 g）。
取二氯甲烷萃取部位（13.7 kg）经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯系统（100∶0→0∶100）梯度洗脱，得5个流分（Fr. 1～5）。流分Fr. 3（3.6 kg）经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯系统（100∶0→0∶100）梯度洗脱，得25个流分（Fr. 3.1～3.25）。
流分Fr. 3.13（96 g）经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯系统（100∶0→0∶100）梯度洗脱，得17个流分（Fr. 3.13.1～3.13.17）。流分Fr. 3.13.7（6 g）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，以石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）等度洗脱，得到13个流分（Fr. 3.13.7.1～3.13.7.13）。流分Fr. 3.13.7.4（2 g）经ODS柱色谱（甲醇-水3∶7→10∶0）并经TLC点板分析合并得到6个流分（Fr. 3.13.7.4.1～3.13.7.4.6）。流分Fr. 3.13.7.4.4经反相制备液相（乙腈-水50∶50）分离纯化，得到化合物1（3.5 mg，tR＝65 min）；流分Fr. 3.13.7.4.5经反相制备液相（甲醇-水65∶35）分离纯化，得到化合物2（10 mg，tR＝73 min）。流分Fr. 3.13.17（4 g）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，以石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）等度洗脱，得到16个流分（Fr. 3.13.17.1～3.13.17.16）。流分Fr. 3.13.17.12经反相制备液相（甲醇-水70∶30）得化合物3（13 mg，tR＝73 min），流分Fr. 3.13.17.14经反相制备液相（甲醇-水75∶25）得化合物4（7 mg，tR＝63 min）。
流分Fr. 3.8（43 g）经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯系统（100∶0→0∶100）梯度洗脱，得到16个流分（Fr. 3.8.1～3.8.16）。流分Fr. 3.8.4（4 g）经Sephadex LH-20型凝胶柱色谱，以石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）等度洗脱，得到6个流分Fr. 3.8.4.1～3.8.4.6。流分Fr. 3.8.4.4经反相制备液相（甲醇-水45∶55）得化合物5（2.5 mg，tR＝101 min）和6（3.5 mg，tR＝116 min）。
3 结构鉴定
化合物1：黄色粉末。[α]20 D +0.3 (c0.05，MeOH)。HR-ESI-MS m/z 383.149 9 [M－H]?（计算值为383.148 9），确定化合物的分子式为C22H24O6，计算其不饱和度为11。红外光谱显示该化合物结构中含有羟基（3 264 cm?1）、苯环（1 604 cm?1和1 550 cm?1）等基团。紫外光谱显示在202 nm和368 nm处有查耳酮类化合物的特征吸收。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)谱（表1）在δH 7.58 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.84 (2H, d, J = 8.8 Hz) 给出1组芳香氢信号，提示存在1, 4-二取代的苯环，δH 6.24 (1H, s) 给出1个芳香氢信号，提示存在五取代苯环片段。δH 7.67 (2H, m) 给出1组双键烯氢质子信号，δH 4.55 (2H, d, J = 7.5 Hz) 给出2个末端烯氢信号；δH 4.15 (1H, m) 给出1个与氧相连的次甲基质子信号，δH 3.88 (3H, s), 3.97 (3H, s) 给出2个甲氧基质子信号，δH 2.68 (2H, m) 给出1组亚甲基质子信号，δH 1.71 (3H, s) 给出1个甲基质子信号。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)谱（表1）中给出22个碳原子信号，结合HSQC谱判断该化合物有8个季碳，8个次甲基，2个亚甲基，3个甲基。其中δC 130.6 (CH×2), 116.0 (CH×2), 87.5 (CH) 为5个苯环上的次甲基碳信号，δC 123.8 (CH), 143.0 (CH)为2个双键上的次甲基碳信号，δC 73.6 (CH) 为1个与氧相连的次甲基碳信号，δC 109.8 (CH2) 为1个末端双键上的亚甲基碳信号，δC 55.8 (CH3), 56.1 (CH3) 为2个甲氧基碳信号，此外δC 192.4 (C) 为1个酮羰基碳信号。

该化合物的波谱数据与已知查耳酮类化合物xanthohumol D的波谱数据非常相似[12]，结合质谱信息发现化合物1与xanthohumol D不同之处在于A环上的1个羟基被甲氧基取代。为进一步确定该甲氧基的取代位置，测试了化合物1的HMBC谱（图2），δH 3.97 (3H, OCH3) 与δC 161.1 (C-6′) 相关，可确定该OCH3连在C-6′上，δH 3.88 (3H, OCH3) 与δC 163.8 (C-4′) 相关，可确定该OCH3连在C-4′上，同时δH 3.97 (3H, s, OCH3) 与δH 3.88 (3H, s, OCH3) 又分别与δC 87.5(C-5′) 相关，提示该化合物的2个甲氧基处在间位。结合δH 2.68 (2H, m, H2-1′′) 与δC 163.3 (C-2′), δC 106.4 (C-3′) 和δC 163.8 (C-4′) 的相关，确定2-羟基-3-甲基-3-丁烯基连接在C-3′上，并进一步确定了化合物1的C-4′位上的羟基被甲氧基取代。结合以上信息，化合物1鉴定为2′,4,-二羟基-4′,6′-二甲氧基-3′-(2-羟基-3-甲基-3-丁烯基) 查耳酮。

进一步，化合物1结构中含1个手性中心，比旋光度近似为0，推测该化合物可能为1对对映异构体。进一步利用手性HPLC对化合物1进行分析[Chiralpak AD-H手性色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，正己烷-乙醇85∶15），体积流量1 mL/min，柱温25℃]，发现在保留时间tR1＝12.20 min和tR2＝19.85 min处有2个峰面积接近1∶1的色谱峰（图3）。

综上所述，化合物1经SciFinder文献数据库检索为1个新的查耳酮类化合物，命名为 (±)-蛇麻花素A [(±)-lupulusone A]。
化合物2：淡黄色粉末。HR-ESI-MS m/z: 299.092 8 [M－H]?，分子式为C17H16O5。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.55 (1H, s, 7′-OH), 7.30 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-2′, 6′), 6.78 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3′, 5′), 6.19 (2H, overlapped, H-6, 8), 5.39 (1H, dd, J = 12.9, 2.9 Hz, H-2), 3.79 (3H, s, 4′-OCH3), 3.77 (3H, s, 5-OCH3), 3.05 (1H, dd, J = 16.6, 13.1 Hz, H-3b), 2.55 (1H, dd, J = 16.4, 3.0 Hz, H-3a)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 78.3 (C-2), 44.7 (C-3), 188.1 (C-4), 161.7 (C-5), 92.8 (C-6), 165.3 (C-7), 93.7 (C-8), 164.4 (C-9), 105.1 (C-10), 129.1 (C-1′), 128.2 (C-2′, 6′), 115.1 (C-3′, 5′), 157.6 (C-4′), 55.7 (5-OCH3), 55.8 (4′-OCH3)。以上数据与文献对比[13]，鉴定化合物2为tsugafolin。
化合物3：黄色粉末。HR-ESI-MS m/z: 355.154 7 [M－H]?，分子式为C21H24O5。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 14.20 (1H, s, 2′-OH), 7.01 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2, 6), 6.66 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3, 5), 6.05 (1H, s, H-5′), 5.11 (1H, t, J = 6.9 Hz, H-2′′), 3.78 (3H, s, 6′-OCH3), 3.16 (2H, m, H-α), 3.11 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-1′′), 2.76 (2H, t, J = 7.7 Hz, H-β), 1.68 (3H, s, H-5′′), 1.59 (3H, s, H-4′′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 204.1 (C=O), 45.6 (C-α), 29.6 (C-β), 131.5 (C-1), 129.1 (C-2, 6), 115.1 (C-3, 5), 155.4 (C-4), 104.0 (C-1′), 163.9 (C-2′), 107.1 (C-3′), 162.4 (C-4′), 90.6 (C-5′), 160.8 (C-6′), 21.0 (C-1′′), 123.0 (C-2′′), 129.9 (C-3′′), 25.5 (C-4′′), 17.7 (C-5′′), 55.6 (6′-OCH3)。以上数据与文献对比[14]，鉴定化合物3为dihydroxanthohumol。
化合物4：黄色粉末。HR-ESI-MS m/z: 367.154 5 [M－H]?，分子式为C22H24O5。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 14.21 (1H, s, 2′-OH), 10.12 (1H, s, 4-OH), 7.73 (2H, m, H-α, β), 7.59 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-2, 6), 6.84 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-3, 5), 6.27 (1H, s, H-5′), 5.09 (1H, m, H-2′′), 3.98 (3H, s, 6′-OCH3), 3.91 (3H, s, 4′-OCH3), 3.16 (2H, d,J = 6.8 Hz, H-1′′), 1.69 (3H, s, H-4′′), 1.60 (3H, s, H-5′′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 192.4 (C=O), 123.6 (C-α), 143.0 (C-β), 125.9 (C-1), 130.7 (C-2, 6), 116.0 (C-3, 5), 160.2 (C-4), 105.5 (C-1′), 162.8 (C-2′), 108.4 (C-3′), 163.1 (C-4′), 87.7 (C-5′), 161.2 (C-6′), 21.0 (C-1′′), 122.7 (C-2′′), 130.3 (C-3′′), 17.6 (C-4′′), 25.5 (C-5′′), 55.9 (4′-OCH3), 56.2 (6′-OCH3)。以上数据与文献对比[12]，鉴定化合物4为4′-O-methylxanthohumol。
化合物5：白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 369.133 9 [M－H]?，分子式为C21H22O6。1H-NMR (400 MHz, Methanol-d4) δ: 7.33 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2′, 6′), 6.82 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-3′, 5′), 6.09 (1H, s, H-6), 5.37 (1H, dd, J = 13.0, 2.9 Hz, H-2), 3.80 (3H, s, 5-OCH3), 3.76 (1H, brt, J = 6.2 Hz, H-2′′), 3.02 (1H, dd, J = 16.6, 13.0 Hz, H-3a), 2.82 (1H, dd, J = 17.0, 5.2 Hz, H-1′′a), 2.69 (1H, dd, J = 16.6, 3.0 Hz, H-3b), 2.55 (1H, dd, J = 17.0, 6.2 Hz, H-1′′b), 1.32 (3H, s, H-5′′), 1.31 (3H, s, H-4′′)；13C-NMR (100 MHz, Methanol-d4) δ: 80.2 (C-2), 46.0 (C-3), 192.6 (C-4), 161.9 (C-5), 94.7 (C-6), 161.8 (C-7), 101.8 (C-8), 163.9 (C-9), 106.2 (C-10), 131.2 (C-1′), 128.9 (C-2′, 6′), 116.3 (C-3′, 5′), 159.0 (C-4′), 26.5 (C-1′′), 69.4 (C-2′′), 79.7 (C-3′′), 21.9 (C-4′′), 25.5 (C-5′′), 56.1 (5-OCH3)。以上数据与文献对比[15]，鉴定化合物5为 (2S,2′′S)-4′-hydroxy-5-methoxy-7,8-(2,2-dimethyl-3-hydroxy-2,3-dihydro-4H-pyrano) flavanone。
化合物6：白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 371.148 5 [M＋H]＋，分子式为C21H22O6。1H-NMR (400 MHz, Methanol-d4) δ: 7.33 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2′, 6′), 6.82 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.08 (1H, s, H-6), 5.37 (1H, dd, J = 12.9, 3.0 Hz, H-2), 3.80 (3H, s, 5-OCH3), 3.74 (1H, dd, J = 7.1, 5.3 Hz, H-2′′), 3.02 (1H, dd, J = 16.6, 12.9 Hz, H-3a), 2.84 (1H, dd, J = 16.9, 5.4 Hz, H-1′′a), 2.69 (1H, dd, J = 16.9, 5.4 Hz, H-3b), 2.50 (1H, dd, J = 16.9, 7.1 Hz, H-1′′b), 1.34 (3H, s, H-5′′), 1.28 (3H, s, H-4′′)；13C-NMR (100 MHz, Methanol-d4) δ: 80.2 (C-2), 46.1 (C-3), 192.6 (C-4), 161.9 (C-5), 94.7 (C-6), 161.8 (C-7), 102.0 (C-8), 163.8 (C-9), 106.2 (C-10), 131.2 (C-1′), 128.8 (C-2′, 6′), 116.3 (C-3′, 5′), 159.0 (C-4′), 26.5 (C-1′′), 69.8 (C-2′′), 79.8 (C-3′′), 21.2 (C-4′′), 25.8 (C-5′′), 56.1 (5-OCH3)。以上数据与文献对比[15]，鉴定化合物6为 (2R,2′′S)-4′-hydroxy-5-methoxy-7,8-(2,2-dimethyl-3-hydroxy-2,3-dihydro-4H-pyrano) flavanone。
4 抗炎活性研究
采用Griess试剂法考察所有化合物对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞释放NO炎性因子的影响[16]。将RAW264.7细胞以约1×104个/孔接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h，去除原有培养基，空白对照组加入100 μL完全培养基，模型组和给药组加入90 μL完全培养基，给药组加入90 μL样品，给药浓度100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L，预处理1 h后，模型组和给药组均加入10 μL LPS（1 μg/mL）诱导，继续培养24 h后，各组吸取上清液50 μL，加入50 μL Griess试剂，继续培养30 min后，用酶标仪于540 nm波长下测定吸光度值，每组设置3个复孔，重复3次。按照公式计算不同浓度梯度下的抑制率，以Graphpad Prism 9软件计算IC50。
抑制率＝(A模型－A给药)/(A模型－A空白)
结果显示，化合物1和4表现出NO释放抑制活性，其IC50值分别为（5.83±1.76）和（10.45±2.36）μmol/L，阳性药地塞米松的IC50值为（13.94±0.04）μmol/L。
5  讨论
研究报道啤酒花具有抗炎活性[17]，本研究发现化合物1和4具有抗炎活性，且抗炎效果优于阳性药地塞米松，表明化合物1和4可能为啤酒花的抗炎药效物质，后续可对化合物1和4抗炎的动物药效及其成药性等方面进行深入研究。本研究进一步丰富了啤酒花的化学成分的多样性，并为啤酒花在抗炎作用阐述方面提供了实验依据。