(二)、LC/MS
HPLC监测技术往往需要标准毒素,而目前已发现60多种MC,多数缺乏标准毒素,这限制了HPLC的进一步应用。LC/MS技术很好地解决了这一问题,即使没有标准毒素,只要知道这种毒素的分子量,就可对其进行定性,而且LC/MS技术亦可对毒素进行精确定量。快速原子轰击质谱(FABMS)和
液相次级离子质谱(LSIMS)是确定毒素分子量的有效手段。
(三)、
气相色谱法(GC)
气相色谱法的一次进样可以对多种物质混合样品的各个组分进行定性、定量分析。
气相色谱法的优点是操作简单、分离效能高、选择性强、分析速度快。局限性主要表现在如果没有标准样品对照,就无法定性分离组分。用于
气相色谱法的检测器多达十几种,如电子捕捉检测器、氢火焰离子化检测器、碱离子化检测器等。其中电子捕捉检测器只对具有电负性的物质(卤素、硝基、氧原子等化合物)有响应,而且选择性强、灵敏度高,广泛应用于有机氯农药和其它含有电负性原子的农药残留检测。
气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术已经比较成熟,结合了
气相色谱分离特性强和质谱仪良好的定性能力,使分离、定量和定性同时进行。但是它的局限性在于只适合于分析可以气化的样品。目前高分辨
气相色谱-高分辨质谱仪(HRGC-HRMS)(High Respective)技术可以检测到单位体积内几个fg的量。如此高的检测灵敏度也会带来一些问题,因为样品可能很快会被接触到的玻璃容器、试剂甚至是实验室的空气所污染。
GC和GC/MS可用于MC总量的测定。
最近又发展了毛细电泳(CE)法。后者分析速度快、具有柱上富集功能并应用激光诱导荧光(laser-induced fluorescence, LIF)检测器提高灵敏度。此外,同生化检测法相比,CE易于实现自动化,避免了放射性物质。TLC也是有效的毒素监测手段,易于操作,不需特殊设备,监测限度可达ng级,但在监测的灵敏度方面要逊色于HPLC。
5.3 细胞毒性检测技术
细胞毒性检测技术是利用毒素对细胞的毒性作用来监测毒素的一种技术,不仅可以判断毒素存在与否,而且可以对毒素进行精确的定量。这种方法监测的也是能发挥相同毒性作用的毒素的总量。
Fladmark等建立了一种根据MC导致鲑鱼或大鼠肝细胞凋亡的程度来确定MC的方法。他们将分离的鲑鱼或大鼠的肝细胞悬浮培养,然后加入MC,根据细胞凋亡的程度即可求出MC的含量,监测限度为10~20ng。
动物细胞凋亡的第一个信号是发生凋亡的细胞与邻近的细胞分离。根据这一特性,Fladmark等还建立了用MC导致悬浮培养的鲑鱼或大鼠肝细胞解聚的程度来监测毒素的方法,所得结果比用判断细胞凋亡的程度所得结果灵敏5~10倍。
5.4 酶活性抑制检测技术
由于MC等能够抑制PP1和PP2A的活性,因此可以通过对酶活性的抑制程度来监测这几种毒素。自Holmes等提出蛋白磷酸酶抑制检测(protein phosphatase inhibition assay, PPIA)技术以来,这种技术得到了迅速发展。PPIA多数以32P标记的糖原磷酸化酶a为底物。由于糖原磷酸化酶a只能被PP1和PP2A水解,而PP1和PP2A又可被MC等抑制,因此在MC、PP和糖原磷酸化酶反应后根据PP水解糖原磷酸化酶a释放出32P的量就可计算出毒素的量。一般用不同浓度的标准毒素MC-LR作标准曲线,用MC-LR的量来代表总毒素的量。随着对硝基苯酚磷酸酯(pNPP)可被PP水解现象的发现,人们建立了一种以pNPP为底物的磷酸酶抑制比色监测技术,根据pNPP被水解后产生的有色产物的多少来确定毒素的量。PPIA的监测限度为pg级,它监测的是能抑制PP的总毒素的量,而不是某一种毒素的量。但蓝藻本身具有的内源蛋白磷酸酶活性有可能使PPIA的结果偏低。