主题：【原创】“色”路蹒跚，任重道远，浅谈复方制剂有关物质测定

关于复方制剂杂质来源归属研究的基本思路，中心电子刊物中已进行了讨论，但在复方制剂的审评过程中我们注意到，有关物质的研究仍然存在不少问题，很多复方制剂药学方面的发补也往往是由于有关物质研究的不规范和限度确定的不合理造成。下面就复方制剂中有关物质定性归属的研究方法谈几点的认识，希望能对研发者在这方面的研究有所帮助。
    1、存在的主要问题
    目前国内很多复方制剂中的有关物质研究中，研究者往往采用某一单方制剂中有关物质研究的HPLC色谱条件或进行微小调整后，将几种主成分进行简单分离，然后用面积归一化法或自身对照法，将各主成分的峰面积之和（或某一主成分的峰面积）作为对照，计算单个杂质和总杂质的量，限度往往定为总杂质不得过X％，或单个杂质不得过X％，总杂质不得过Y％。未对处方中各主成分的有关物质进行分别研究和分别控制，限度的确定没有依据，且可能存在较大的安全性隐患。
    2、问题分析
    由于历史的原因，目前国内不少单方制剂的有关物质限度多采用自身对照法，仅限定单个杂质和总杂质。这种方法尽管与ICH的要求还有差距，但对相对控制药品的质量和保证药品的安全有效也起到了积极的作用。然而，这种方法对于控制复方制剂中的有关物质则可能存在很大的风险。
    由于复方制剂中几种主成分的量往往差别很大，或者紫外响应值不同，表现在HPLC图谱中，几种主成分往往有几倍甚至几十倍的积分面积差别。这时，对于积分面积较小的主成分，其有关物质在计算时往往会被忽略，即使其有关物质与其单方制剂相比已经高很多，总有关物质的量仍然符合申报的限度要求。这时，该主成分的有关物质就可能会产生安全性问题。例如：某国内首创的复方制剂，两种主成分的HPLC积分面积相差25倍左右，申报单位在有关物质计算时，将两种主成分峰面积之和的1％作为对照，对其中的各种有关物质进行计算，标准中仅简单规定了单个杂质和总杂质。审评时我们发现，由于两种主成分的相容性问题，积分面积较小的主成分稳定性较差，其有关物质已经有了明显增加，远远高于单方制剂的限度，但采用这种方法计算后却显示其有关物质未见明显增加，如此控制就存在着很大的安全性隐患，因而我们认为采用该方法进行有关物质检查明显不合理。
    针对上述问题，我们建议在复方制剂的有关物质研究中，对各主成分的有关物质进行分别研究和分别控制。
    3、定性归属方法
    对各主成分进行分别控制的基础是：我们必须首先将各有关物质分别归属为各个主成分。对于这种归属，很多申报单位认为有一定难度，研究不深入。事实上，由于有关物质与主成分存在渊源关系，因而仅进行归属研究并不是一件非常困难的事情。归属的方法可以有多种，较常使用的有HPLC峰保留时间对比法和LC-MS联用方法等。
    （1）HPLC峰保留时间对比法
    峰保留时间法是采用HPLC法，在相同的色谱条件下分别测定复方制剂和各主成分（原料药或相同辅料单方片）的HPLC图谱，经对比研究将各个有关物质归属为不同的主成分，在质量标准中用相对保留时间法将各杂质归属为不同的主成分，然后分别进行控制。HPLC峰保留时间对比法具有方便、快捷的优点，但对于制成复方制剂后新增加的杂质则无法进行控制，需要LC-MS等其他的方法研究确定。不过，仍然可以采用相对保留时间来表征各有关物质的归属情况。
    （2）LC-MS联用法
    LC-MS联用法是对复方制剂中的有关物质进行归属的最为有效的方法之一。该方法可以采用液质联用仪对复方制剂HPLC图谱中出现的各个主要色谱峰分别进行质谱分析，获得各主要杂质的一级质谱图和二级质谱图，根据各杂质的分子离子峰和及裂解后产生的碎片离子峰的信息进行初步的质谱分析，从而推测杂质是由哪种主成分产生的。由于主成分与其相应的有关物质一般皆具有渊源关系，可利用质谱中出现的一些信息进行归属。通常我们可以根据观察主成分中存在的特征官能团和特征元素进行归属：
    ①观察特征官能团：在质谱图中，主成分及其有关物质往往会出现系列相似的特征碎片离子峰，例如：主成分中如苯磺酰基、氯/氟代苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、四氮唑等等基团时，其工艺杂质和降解产物一般也会出现这些基团的特征峰，经与主成分的质谱图进行简单对比即可进行归属。在多数情况下，我们无需确定该有关物质的结构即可将其归属为某一主成分的有关物质。如苯磺酰基为较为稳定的结构，如果化合物结构中含有苯磺酰基结构，在其质谱的裂解图中，一般都会出现m/e 142的特征峰，因而如果主成分中有苯磺酰基结构，则有关物质的质谱图中出现m/e 142峰的则可初步确定该峰为该主成分的有关物质。
    ②观察特征元素：某些元素具有很强的特征性，可以帮助确定有关物质的归属，例如：某复方制剂中的主成分之一的结构中存在溴代基团，其有关物质的结构中也多为溴取代产物，因而在质谱中该主成分的有关物质就会出现溴的特征质谱峰（m/e相差2、丰度相当的双峰），对于我们的归属研究具有很好的提示作用。

以上为个人对复方制剂中有关物质定性归属的研究方法的粗浅认识，不当之处欢迎讨论。需要说明的是，定性归属仅仅是复方制剂有关物质研究的第一步，在完成归属后仍然需要进行一系列的方法学研究才能最终确定方法。而且目前这种方法仅是对复方中各主成分的有关物质进行分别归属和控制，随着我们对有关物质研究的不断深入，对有关物质控制的要求不断提高，对复方制剂中出现的每一个有关物质进行分别鉴定和分别控制也必然成为将来复方制剂有关物质研究的趋势。

个人研究举例：

阿莫西林双氯西林钠胶囊有关物质研究，色谱条件：

有关物质取装量差异项下的内容物适量，精密称定，用磷酸盐缓冲液溶液[0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇-乙腈（550:200:250）]溶解并稀释制成每1ml中约含阿莫西林2mg/ml的溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，用磷酸盐缓冲液溶液稀释至刻度，作为对照溶液。照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V  D）测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为0.1mol/L磷酸二氢钾溶液-0.018mol/L十二烷基硫酸钠-甲醇-乙腈（275:275:200:250），用磷酸调节pH值至2.0；流动相B为乙腈；流速为每分钟1.0ml；检测波长为225nm。以下表进行线性梯度洗脱。理论板数按阿莫西林峰计算不低于2000。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%～25%。再精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液阿莫西林主峰面积的2倍（2.0%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液阿莫西林主峰面积的5倍（5.0%）。（供试品溶液中任何小于对照溶液主峰面积0.05倍的峰可忽略不计）。