主题：【第六届原创】金莲花中槲皮素的提取考察及含量测定方法探讨

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发表于：2013/10/16 10:04:47 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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金莲花中槲皮素的提取考察及含量测定方法探讨

试验目的：选择合适的提取方法对金莲花中槲皮素达到最大提取并摸索槲皮素的HPLC提取方法。

采用方法：采用高效液相色谱法（HPLC），色谱条件：色谱柱：YWG C₁₈，（10μm,4.6mm×250mm）流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液（60︰40），流速：1.0mL·min^-1，柱温：25℃，检测波长：370nm。

结果：槲皮素在15.6~500.0μg·mL^-1呈良好的线性关系（r=0.999 5），平均回收率为100.5%，RSD= 1.2%。理论塔板数按槲皮素峰计不低于5000，

用HPLC法对金莲花中槲皮素含量测定，方法可靠。灵敏度高。用丙酮提取色素后的金莲花中槲皮素的含量与金莲花原药中的槲皮素含量相比稍低；提取色素后的金莲花和金莲花原药中的槲皮素含量均在超声提取70min时出现最大值。

金莲花（Trollius chinensis Bunge.）为毛茛科植物金莲花的干燥花，已知其有效成分单体有荭草苷、牡荆苷等黄酮碳苷类化合物和槲皮素-新橙皮糖等氧苷黄酮类物质。近年来研究发现，金莲花具有很好的抗菌、抗病毒作用。金莲花提取物中槲皮素的药理作用也受到广泛关注。槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒,清除自由基、抑制恶性肿瘤生长和转移等多方面药理作用。文献报道多以HPLC法测定金莲花及其制剂中荭草苷和牡荆苷的含量为控制质量的依据，金莲花中含有槲皮素，而以HPLC法测金莲花提取物中槲皮素含量作为质量监控未见报道，本研究目的在于建立HPLC测定金莲花提取物中槲皮素的方法，比较不同超声提取时间槲皮素的提取率。

金莲花的药用价值越来越得到人们的重视，极具开发价值，此实验为进一步有效开发利用这里的金莲花资源提供了依据。

1.仪器、试剂与药品

1.1仪器

Agilent1100高效液相色谱仪（1100VWD紫外检测器）

KQ -500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）

四两重高速中药粉碎机（浙江省温岭器械厂）

MP1100B型电子天平（上海精科天平）

GR-202型十万分之一电子天平（日本）

HQ-60型旋涡混合器（北京生物技术发展有限公司）

756MC型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）

1.2试剂与药品

槲皮素标准品（中国药品生物制品检定所）

金莲花采购于药材批发市场

甲醇、磷酸为色谱纯，其他试剂为分析纯。

三重蒸馏水（实验中心自制）

2.方法

2.1最大吸收波长的确定

吸取一定量用甲醇配制的槲皮素标准溶液，用石英比色皿在可见紫外分光光度计的220-450nm区间进行紫外扫描，（见图1）可得到槲皮素的紫外—可见吸收光谱图。选择确定槲皮素的检测波长。

2.2色谱条件

色谱柱：YWG C₁₈（4.6mm×200mm，10μm），流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液（60︰40），流速：1.0mL_˙min^-1，检测波长：370nm，柱温：25℃，进样量：20μl。

2.3 标准品溶液的制备

精密称取槲皮素标准品2.0mg，置于2mL的EP管中，加甲醇1mL，旋涡混合器上使之充分溶解，并定容于1mL容量瓶，过0.45μm的微孔滤膜，即得标准品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

精密称定干燥粉碎的金莲花和丙酮提取色素的金莲花残渣，分别置于250mL具塞锥形瓶中，用移液管分别各加入甲醇40 mL和25％盐酸10mL，称重，超声处理不同时间，取出，放冷。用甲醇补足损失的重量，摇匀，取上清液1 mL用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.5 标准工作曲线的建立

将已配制好的标准品溶液(2.0 mg·mL^-1)倍比稀释至4，8，16，64，128倍。按上述色谱条件进样。

2.6精密度实验

取同一份供试品溶液，重复进样5次，测定槲皮素的峰面积,计算RSD.结果见表1。

2.7稳定性实验

称取金莲花0.2g。按2.4方法制备供试品溶液。取室温下放置0、1、2、3、4、5、6h的供试品溶液分别进样，测定槲皮素的峰面积。结果见表2。

2.8加样回收率实验

取已知槲皮素含量的金莲花供试品溶液，置于五个EP管中，再分别加入槲皮素标准品溶液0.5 mL ，1.0mL ，1.5 mL ，2 .0mL ，2.5 mL 。用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取20μl进样。测定峰面积，计算加样回收率、RSD。结果见表3。

2.9样品含量测定

取上述各供试品溶液，各取20μl进样，测定峰面积。计算结果见表4，表5。

从实验结果来看，原药金莲花中槲皮素的提取率随时间逐渐增大，70min达到最大值。丙酮去色素的金莲花槲皮素的提取率同样在70min达到最大值。

试验结果

1. 从紫外扫描图上可见（见图1），槲皮素在254nm和370nm处都有较强紫外吸收，但甲醇在254nm处也有吸收。为了避免甲醇的干扰测定，选择370nm作为检测波长。

2. 按上述色谱条件，测得槲皮素出峰时间为6.889 min。（见图2）

3.以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，得到标准曲线。回归方程: Area=44.465C-201.15; r=0.999 52。（见图4）

4.精密度实验测定结果(见表1)。RSD=0.82%，精密度良好。

5. 稳定性实验测定结果(见表2)。槲皮素在4h内稳定。RSD=2.4%。

6. 加样回收率实验测得结果。 (见表3)回收率均值=100.5%，RSD=1.2%。

7. 样品含量测定结果 (见表4，表5)。未去色素的金莲花中槲皮素含量为3.13%;去色素后含量为2.35%。

结果讨论

1.检测波长的选择：从紫外扫描图上可见（见图1），槲皮素在254nm和370nm处都有较强紫外吸收。但考虑到甲醇溶剂峰在靠近254nm处也有最大吸收。为了避免甲醇的干扰，故选择370nm作为槲皮素的检测波长。

2.本实验采用了不同超声时间提取金莲花中槲皮素。从实验结果来看超声时间70min是最佳提取时间。槲皮素在4h内稳定。

用高效液相色谱法测定槲皮素的含量，方法简便，灵敏，准确，重现性好，可作为金莲花及其制剂的质量监控方法。

3. 用高效液相色谱法测定金莲花中槲皮素的含量，该方法操作简便，结果准确，可用于金莲花药材的质量监控。

4. 不同超声时间提取金莲花中槲皮素，去色素组和不去色素组均在70min出现最大值，因此70min作为槲皮素的最佳提取时间。

5. 槲皮素在4h内稳定。

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