主题：【第八届原创】创新性黄曲霉毒素检测方法（一步净化法）

固相萃取-高效液相色谱法检测乳品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁

摘要：建立测定乳品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁含量的固相萃取-高效液相色谱方法。样品经乙腈提取，ProElut AFT固相萃取柱净化，以正己烷和三氟乙酸衍生后，通过DiamonsilC18(2)色谱柱分离，流动相为水、乙腈和异丙醇，梯度洗脱，流速1 mL/min，荧光检测器检测，激发波长365nm，发射波长435 nm，外标法定量。结果表明5种黄曲霉毒素在0.01~5μg/L范围内线性关系良好。样品加标回收率在80%~100%之间，相对标准偏差1.58%~4.21%，方法检出限为牛奶：0.02~0.06μg/kg，奶粉：0.04~0.12 μg/kg。
      黄曲霉毒素(AFT)是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物，是现在发现的毒性和致癌性最强的天然污染物，其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁是最为常见且最重要的五种衍生物，可存在于土壤、坚果、谷物、食用油、及乳制品中。由于新生儿童免疫系统不完善，抵抗力较弱，所以婴幼儿食品尤其是奶粉、牛奶中黄曲霉毒素的检测尤为重要。
        目前，黄曲霉毒素的检测方法有薄层色谱法(TLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、高效液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)；高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)。TLC法对人和环境的污染系数大，操作繁琐，灵敏度不高，很难普及。ELISA方法虽然操作简单，但定量不精确，易出现假阳性结果。HPLC-MS法仪器昂贵，检测成本较高，而HPLC-FLD操作简单，选择性好，灵敏度高，定量准确，同时仪器价格适中，适宜推广。另外，乳制品成分复杂、蛋白含量高、含有多种维生素及微量元素，所以样品净化在检测过程中占有重要的地位，目前的净化方法主要采用免疫亲和柱(IAC)净化和其它固相萃取柱净化，如石墨化碳黑柱；CN柱；HLB柱等。IAC虽然选择性好但是价格昂贵、储存条件苛刻、保存期短，其它固相萃取柱净化过程中涉及步骤较多，且净化效果一般。故本文选择ProElutAFT固相萃取柱结合高效液相色谱荧光检测器测定乳品中黄曲霉毒素，方法灵敏度高，步骤简单，净化效果好，成本较低，适合推广。

1 实验部分
1.1仪器与试剂
岛津LC-20A高效液相色谱仪，RF-20A荧光检测器，柱温箱，涡旋混合器(予华仪器)，高速离心机(予华仪器)，旋转蒸发仪(予华仪器)，12孔固相萃取装置(迪马公司)，Diamonsil C18(2)，250 mm×4.6 mm，5 μm色谱柱(迪马公司)，ProElut AFT固相萃取柱(迪马公司)。
乙腈、甲醇、异丙醇均为色谱纯(迪马公司)，黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁标准品浓度10 μg/mL(Sigma)。分别取标准品各10 μL于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配置成10ng/mL中间液，0-4 ℃避光保存。
1.2色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18(2)，250 mm×4.6 mm，5 μm；流速：1 mL/min；检测器：FLD，Ex: 365 nm，Em: 435nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；流动相：A-水；B-异丙醇 : 乙腈=3 : 2；
梯度程序：


1.3样品提取
1.3.1牛奶、原料乳等液态奶制品
称取2 g样品，加入2mL乙腈，涡旋混合1 min，再加入4 mL乙腈，涡旋混合1 min，4000 rpm，离心5 min，取上清液4 mL，作为上样液待净化。
1.3.2奶粉等固体奶制品
称取2 g样品，加入5mL水，涡旋混合2 min，样品与水充分混匀，加入5 mL乙腈，涡旋混合1 min，再加入10 mL乙腈，涡旋混合1 min，4000 rpm，离心5 min，取上清液5 mL，作为上样液待净化。
1.4样品净化
用10mL乙腈活化ProElut AFT固相萃取柱，将上样液加入柱中(流速控制每滴/两秒)，接收流出液，采用10 mL乙腈洗脱样品(流速控制每滴/两秒)，收集流出液，合并流出液，在40 ℃下减压蒸馏浓缩至大约2 mL，向旋蒸瓶中加入5 mL无水乙醇，继续减压蒸馏至完全干燥，依次加入0.5 mL正己烷和0.5 mL三氟乙酸，旋好玻璃塞充分混匀衍生液，45 ℃静置10 min，然后挥干衍生液，用10%乙腈水溶液定容至0.5 mL，待检测。
2结果与讨论
2.1色谱条件的选择
分别考察了不同比例的甲醇-水、乙腈-水、乙腈-异丙醇-水为流动相对五种黄曲霉毒素分离的影响，结果表明，在A相为水，B相为异丙醇: 乙腈=3 : 2条件下进行梯度洗脱，可使五种黄曲霉毒素达到很好的分离效果(图1)。原因为乙腈中加入异丙醇可降低流动相极性，增加样品与色谱填料间的吸附-脱附次数，从而增加分离度。

2.2提取溶剂的选择
比较了正己烷、甲醇、乙腈对黄曲霉毒素的提取效果，结果表明用正己烷提取时会产生乳化现象，且会提取出大量脂肪，影响净化效果；甲醇提取同时可除掉部分蛋白，但是也会有少量脂肪溶解；乙腈作为提取溶剂既可除掉绝大多数蛋白质，同时对油脂的溶解度大大降低，因此本实验采用乙腈作为提取溶剂。
2.3固相萃取柱的选择
对于乳及乳制品类样品，采用固相萃取柱进行样品进化是必不可少的步骤。本文采用了硅胶、氨基、PSA、C18、CARB、AFT填料的固相萃取柱，发现采用硅胶柱时黄曲霉毒素回收率极低，应该是样品与硅羟基形成了部分死吸附导致；采用氨基柱、PSA柱净化，可吸附少量的油脂及酸性杂质；采用C18柱可吸附弱极性和中等极性的维生素、脂肪等杂质，但这些固相萃取柱都不能达到同时吸附样品中多种干扰物的效果。AFT萃取柱为黄曲霉毒素检测专用多功能净化柱，可在保证高回收率的前提下同时吸附蛋白、脂肪、维生素、微量元素等干扰物，达到很好的净化效果(图2、图3)。


2.4回收率结果
分别对牛奶、奶粉进行加标回收试验，每个样品平行测定6次，计算回收率及RSD值(表1、表2)。结果表明，牛奶中添加的黄曲霉毒素回收率为83%-93%、RSD为1.5%-2.8%；奶粉中添加黄曲霉毒素回收率为75%-96%、RSD为1.7%-4.2%，结果满意。
3.结论
黄曲霉毒素毒性强，若存在于食品中尤其是婴幼儿食品中会对人类造成极大的伤害。本文建立测定乳品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁含量的固相萃取-高效液相色谱方法，本方法通用性强、灵敏度高、重现性好、结果准确，符合现代技术的发展趋势。

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