一、方法概述
1.范围
本标准规定了用高效液相色谱法测定食品中6-苄基腺嘌呤（6-BA）含量的方法。
本标准适用于果蔬菜（豆芽、黄瓜、番茄、香菇、草莓、橙类）等植物性食品及其制品中6-苄基腺嘌呤的测定。
2.规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方面研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)
3.方法提要
试样经甲醇提取、浓缩并净化后，用高效液相色谱检测，外标法定量。
二、仪器与试剂
1. 仪器
1.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
1.2 组织捣碎机。
1.3离心机：转速不低于4000r/min。
1.4超声波清洗仪。
1.5旋转蒸发仪。
1.6固相萃取装置。
1.7电子天平：感量0.1mg。
1.8微孔滤膜：0.45μm，有机相。
以上仪器符合国标要求。
2. 试剂及其配制
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
2.1甲醇：色谱纯。
2.2冰乙酸。
2.3 C₁₈固相萃取柱：6mL，500mg，或相当者，使用前依次用5mL甲醇、10mL水活化。
2.4乙酸铵溶液（0.02mol/L）：称取1.54g乙酸铵，用适量水溶解，加入1.0mL冰乙酸，加水定容至1000mL。
2.5 6-苄基腺嘌呤标准溶液（100.0μg/mL）来源：农业部环境保护科研监测所货号：SB05-368-2016
三、分析步骤
1、标准曲线绘制
1.1 标准工作液的配制：
分别吸取适量6-苄基腺嘌呤标准溶液，用甲醇定容至10mL容量瓶中，配制成浓度为0.04μg/mL、0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL系列工作液。
2、样品的处理
2.1提取：称取经组织捣碎机捣碎的样品约10g（精确到0.01g）于50mL离心管中，加入20mL甲醇，超声提取15min，以转速不低于4000r/min离心10min，上清液转入50mL梨形瓶中，样品再次用20mL甲醇超声提取15min，离心合并上清液，用旋转蒸发仪（不超过60℃）浓缩至近干，去除甲醇，残液待净化。
2.2纯化：将上述2.1残液以2mL/min流速通过预先活化的固相萃取柱，用少量水（约2mL）洗涤梨形瓶，洗液过固相萃取柱，再用5mL水洗涤固相萃取柱，去除杂质后用甲醇洗脱并定容至5.0mL，混匀后经0.45μm滤膜过滤，作为待测液供HPLC分析。
3.仪器测定条件
3.1色谱柱：C18柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm或相当型号色谱柱。
3.2流速：1.0mL/min。
3.3柱温：30℃。
3.4检测波长：267nm。
3.5进样量：10μL。
3.6流动相：甲醇：0.02mol/L乙酸铵溶液=1:1
四、结果处理
试样6-苄基腺嘌呤含量按下式进行计算：

X(mg/kg)=	C×V×1000
	m×1000

式中:X-试样中6-苄基腺嘌呤含量,单位为毫克每千克(mg/kg);
C-由标准曲线计算出样液中6-苄基腺嘌呤的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
m-试样质量,单位为克(g);
V-试样的最终定容体积,单位为毫升(mL)。
1000—换算系数。
计算结果保留两位有效数字。
五、验证结果
1.线性结果
将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
同时做空白实验。
6-苄基腺嘌呤Y=74074.3*X-65.9497 R^2=0.9999959

以上结果表明6-苄基腺嘌呤在0.04μg/mL～2.5μg/mL范围内，R^{^2}=0.9999959，6-苄基腺嘌呤浓度和峰面积呈线性关系，线性良好，符合要求。
2.检出限结果
将0.25μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出6-苄基腺嘌呤的方法检出限为0.0125mg/kg，此检出限结果小于国标GB/T 23381-2009的方法检出限0.02mg/kg，故此方法满足条件。
六、方法精密度（重复性）
对LBF180700282样品分别进行6次加标重复性的测定，测定结果如下：

测定编号	1	2	3	4	5	6
质量（g）	10.0031	10.0016	10.0025	10.0044	10.0027	10.0048
浓度（μg/mL）	0.652	0.650	0.652	0.652	0.652	0.651
含量（mg/kg）	0.33	0.32	0.33	0.33	0.33	0.33
平均值（mg/kg）	0.33
RSD%	1.24

本方法的精密度为1.24%，符合GB/T 23381-2009中给出试样测试结果的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
七、准确度验证（加标回收）
对LBF180700282样品加标，取2.5μg/mL的标液0.09mL、0.35mL、0.64mL同样品同步处理后，结果见下表：

测定编号		6-苄基腺嘌呤
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	6-苄基腺嘌呤含量（mg/kg）	平均值（mg/kg）	加标量（mg/kg）	回收率%
1#	10.0236	5.0	N.D	N.D	N.D	/	/
2#	10.0157	5.0	N.D	N.D	N.D	/	/
加标1#	10.0087	5.0	0.042	0.021	0.021	0.022	95.5
加标2#	10.0103	5.0	0.163	0.081	0.081	0.087	93.1
加标3#	10.0189	5.0	0.307	0.15	0.15	0.16	93.8