某生猪定点屠宰场非洲猪瘟自检结果多次不合格，为探究原因，近期对其所用试剂、设备及人员操作等方面进行检查，结果如下：

1.扩增部分

2020年4月25日，对某生猪定点屠宰场所用扩增试剂进行验证。样品采用经本站检测有明确结果的核酸，扩增设备采用该场所用PCR仪，扩增试剂采有该场使用的扩增试剂，结果如下：

设定值	检测结果	差值	备注
P1已知核酸	24.90	19.89	-5.01
P2已知核酸	28.17	23.94	-4.23
P3已知核酸	31.64	26.69	-4.95

考虑到该屠宰场PCR仪扩增程序中设置了5个循环的预扩增，扩增结果会比正常扩增程序Ct值减少5个。加上这5个循环后，检测结果与设定值吻合程度很高，说明所用扩增试剂、PCR仪及移液器、人员操作均无大的问题。

结合该场多次未能对盲样得出检测结果，初步分析问题出在核酸提取阶段，可能的原因有：一是提取试剂存在质量问题，二是检测人员取样不当，三是所用离心机转速偏低，四是检测人员操作不当。

2.核酸提取部分

2020年4月27日，对某屠宰场所用核酸提取试剂进行验证。样品采用经我站检测有明确结果的模拟阳性样品，提取试剂采用该场使用的提取试剂，扩增试剂采用本站使用的扩增试剂（某屠宰场试剂扩增程序无法在本站PCR仪运行），扩增设备采用本站PCR仪，离心机分别采用6000转/分和12000转/分，结果如下：

设定值	检测结果	差值	备注
P2模拟样品	28.17	32.88	+4.71	6000转/分
P2模拟样品	28.17	32.96	+4.79	12000转/分
P3模拟样品	31.64	35.87	+4.23	6000转/分
P3模拟样品	31.64	35.83	+4.19	12000转/分

考虑到某屠宰场所用的提取试剂为粗提方式，最终核酸体积为样品的6倍，而本站所用的提取试剂为柱提方式，最终核酸体积为样品的1/4，两者体积相差24倍，折算成Ct值为4.6。扣除这些影响因素后，所得结果与设定值吻合程度很高，说明提取试剂本身无大的问题。另外，考察离心机不同速度，两者得出的结果吻合程度也非常高，说明离心机两种转速对核酸提取的影响程度很小。

3.结果不理想原因分析

3.1核酸提取试剂反复冻融导致提取效率下降

4月25日某屠宰场第一次对模拟阳性样品（Ct值24.90）进行提取和扩增，所采用的核酸提取试剂已反复冻融4次，P1模拟阳性样品Ct值33.28。与标准操作相比，样品加入量仅为1/4引起Ct值增加2，粗提引起Ct值增加4.6，5+40次循环引起Ct值减少5，影响因素叠加引起Ct值增加1.6，扣除影响因素Ct值相差6.78，同时P2和P3样品则均未检出。

而直接用核酸进行扩增，结果吻合程度很高，说明核酸提取试剂反复冻融可能导致提取效率快速下降。

3.2冷冻保存试剂未充分回温

4月25日某屠宰场第二次对模拟阳性样品（用阴性血浆配制）进行核酸提取时，加入量为40μL，但提取试剂未充分回温，大部分尚未融化即开始提取，结果所有模拟阳性样品均未检出。说明试剂充分回温，对于提取效果非常重要。

3.3样品加入量不当

某屠宰场所用核酸提取试剂的说明书明确规定，抗凝血加入量10μL，血浆加入量40μL。但4月25日某屠宰场对模拟阳性样品（用阴性血浆配制）进行第一次核酸提取时，提取试剂经回温，但样品加入量仅为10μL，这种操作会导致最终结果Ct值增加2。

4操作建议

4.1提取试剂避免反复冻融

在第一次启用提取试剂时，取洁净离心管将提取试剂分装成小份后冷冻保存，具体每份的体积视检测量而定，以1~2次用完为宜。每次只取1份或2份，未用完的冷藏保存，并于第2天用完。

4.2试剂应充分回温

不论提取试剂还是扩增试剂，均应充分回温后方可进行操作。在室温较低且未配备水浴锅的情况下，可用杯子盛上温水（以不超过40℃为宜），将试剂投入后进行回温，待试剂完全融化且温度达到20℃~30℃左右方可取出使用。

4.3严格按照说明书加入样品

提取试剂盒说明书明确抗凝血取10μL、血浆或血清取40μL，对于说明书未明确说明加入量的，如比对时的病毒悬液，应及时向兽医实验室技术人员或试剂盒生产厂家技术人员咨询。

4.4冷冻试剂融化或混匀操作后进行瞬时离心

冷冻试剂融化或混匀操作容易将液体溅到离心管壁和管盖，应瞬时离心时再开盖进行下一步操作，以免造成污染和液体损失。

4.5操作时应避免引起交叉污染

在开启离心管盖时，应该用右手拇指和食指扣住离心管盖外沿，缓慢、小心开启离心管盖，避免用左手拇指肚顶住离心管盖向上弹开，此类操作因离心管内压力骤降极易引起管内液体溅出，且拇指肚极易接触离心管盖内壁造成交叉污染。

4.6提取环节增加阴阳对照

目前多数快速检测试剂盒，仅要求在扩增环节添加阴阳对照。此种情况下，如果提取试剂出现问题，或提取环节操作不当，检测人员很难发现问题。建议屠宰场自检实验室在提取环节增加阴阳对照，对提取环节进行质量控制：如阴性对照出现阳性结果，说明提取过程受到污染，如阳性对照Ct值偏高或无Ct值，说明提取试剂有问题，或操作不当未成功提取核酸。

4.7结果判定应严格遵守试剂盒说明书

试剂盒说明书明确规定：Ct值小于35判为阳性，介于35~38且有典型扩增曲线判为可疑应再次检测，若结果重复则判为阳性。但PCR仪却简单设置为Ct值小于35判为阳性，Ct值大于35判为阴性，导致Ct值介于35~38的样品错判结果。应及时联系设备厂家，请技术人员及时调整判定条件。

4.8建议核酸采用柱式提取

与柱式提取相比，目前屠宰场普遍采用的粗提法，存在核酸浓度低、杂质多等缺点，对于复杂样品如抗凝血检测效果不理想。建议有条件的自检实验室改用柱式提取，以切实提高检测质量。

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主题：【第十三届原创】屠宰场非洲猪瘟检测结果不理想原因分析