1样品采集及保存

1.1样品种类

屠宰企业非洲猪瘟自检首选样品是抗凝血，但抗凝血提取核酸不太方便，且采样成本较高，有的企业改用血浆或血清检测。

对于是否可以采用血浆或血清检测，需要综合考虑以下因素：一是设备，血浆或血清需要采用离心机分离；二是检测过程，抗凝血含有红细胞、血小板及抗凝剂，对提取及扩增有一定影响；而血浆或血清较纯净，对后续处理影响程度较小；三是检测结果，据青岛立见数据，来源相同的情况下，与抗凝血相比，血浆的Ct值增加1左右，血清的Ct值增加2左右。各地可根据具体实际，分析确定采用何种样品。

1.2采样器材

首选采血针/注射器/头皮针+抗凝管，但抗凝管成本高，有的企业改用采血静置分离血浆或血清用于检测。

针对抗凝管价格偏高的问题，可改用“普通离心管+抗凝剂”替代。经查阅资料，一般认为1.5mgEDTA可以阻止1mL血液凝固。为方便采样，一般将EDTA配制成浓度为15g/L的生理盐水溶液，按1/10比例加入离心管，如1.5mL离心管加入0.15mL，可于40℃左右烘干，也可直接使用。血液注入该离心管后，应颠倒数次将全血与抗凝剂充分混匀。应该注意的是，EDTA浓度过高会影响后续的提取及检测结果。因此，一是要严格按照比例添加抗凝剂，二是加入血液量不足时，要向离心管中补足生理盐水或PBS液。

1.3混样比例

考虑到试剂盒灵敏度，以及企业成本接受能力，混样比例控制在1:10左右较好（粗提），如果采用柱式提取，可将混样比例提高到1:100。

是否可以高比例混样，需从以下几个方面考虑：一是对Ct值的影响，相对于疫控机构常用的1:5混样来说，1:20混样Ct值约增加2.0，1:100混样约增加4.3，1:500混样约增加6.7。二是对提取效率的影响，在柱式提取中，混样比例过高会导致样品中病毒核酸含量极低，提取柱的吸附膜可能无法与病毒核酸有效结合，导致假阴性；三是对扩增结果的影响，理论上核酸稀释多倍后，只要扩增循环数足够多，仍能检测出阳性结果。但扩增体系中核酸浓度过低时，引物探针可能无法与核酸有效结合，导致假阴性。

1.4样品保存

对于屠宰企业自检后的样品，推荐冷冻保存半年以上。但目前多数企业仅保存一个月左右。根据农业农村部2019年11月文件，要求对屠宰企业2019年5月1日后的留样进行复检。从该文件上可以看出，部级层面是要求留样长期保存的。

1.5留样要足

政府机构实验室普遍采用柱提法提取核酸，取样量一般每次需200μL，因此留样量不宜少于1mL。

2核酸提取

2.1提取方式

为了提高核酸提取效率和非洲猪瘟检出率，推荐采用柱式提取。但目前多数企业采用粗提（本人一直反对免提的说法，因为目前市面上的免提试剂盒，实际上还是有核酸提取的试剂和过程，只不过不进行洗脱而已，所以实际上是粗提而不是免提）。

屠宰企业是否可以粗提，需要考虑以下问题：一是粗提后的核酸，含有EDTA等影响后续扩增效果的成分，如果扩增时取样不仔细，还可能吸入红细胞等杂质，影响扩增结果的准确性；二是柱式提取一般取样200μL得核酸50μL，相当于浓缩4倍，而粗提一般取样10μL得核酸混合液210μL，相当于稀释21倍。在其他因素相同的情况下，粗提核酸比柱提结果Ct值约增加6.4。如果叠加上混样比例1:200导致的Ct值约增加5.3，影响值可以达到11.7，绝大多数阳性样品都会出现阴性结果！

结论：高混样比例和粗提，两者只能选其一，且推荐采用柱式提取。

1:5

1:20

1:100

1:500

柱提

首选

（以此为基准）

可接受可推荐

Ct值+2.0

可接受

Ct值+4.3

可接受不推荐

Ct值+6.7

粗提

可接受不推荐

Ct值+6.4

可接受不推荐

Ct值+8.4

不可接受

Ct值+10.7

不可接受

Ct值+13.1

2.2提取器材

一是离心机：不管是柱提还是粗提，均需要使用离心机。因非洲猪瘟病毒是DNA病毒，对温度的影响不太敏感，因此屠宰场自检可不使用冷冻离心机。离心速率建议10000转/分以上，条件有限的情况下也可使用6000转/分，但时间要延长一倍。建议使用多合一转子，八联管与2mL离心管可以在同一个转子上离心，不必每次更换转子。

二是移液器：PCR扩增体系取液量很少，且精度要求高，建议使用进口移液器；柱提取样量较大，可使用国产移液器；粗提取样量较小，建议使用进口移液器。

三是移液器吸头：PCR由于扩增效率极高，很容易造成污染，导致假阳性结果。因此在取样、提取和扩增各环节，务必使用滤芯吸头。

2.3提取过程

一是注重防护。提取过程必须穿工作服，戴口罩、手套。在提取过程中，一旦发现或怀疑手套受到污染，应立即更换！

二是环境消毒。此处的消毒，更多的是指使核酸降解，而不是使病毒失去活力。在实验开始前，需用含0.3%有效氯的消毒液喷洒实验台面作用1分钟后用纸巾擦干，然后用75%酒精处理一遍，有条件的可再用DNA祛除剂处理一遍。对移液器等器材也可采用相同方法对外表面进行类似处理。

三是试剂回温。冷冻或冷藏的试剂，应提前取出在室温中静置一段时间，待试剂回到室温后再使用。

四是瞬时离心。所有试剂或样品，在回温后使用前，均需瞬时离心，将液体甩至管底，确保管盖或管壁。有特殊规定不能离心的除外！

五是取样准确。取样前核对移液器量程是否设置正确，插入液体前应将活塞揿到第一阻力位稍向下，吸入液体取出后应检查吸头内是否有气泡，移出液体后应检查吸头内是否还有少量液体。

六是更换吸头。除非向空的离心管内首次加入液体，或移液时不接触离心管及管内液体，否则每加一次液体均应更换吸头。

七是冷却加液。核酸提取过程一般均有加热反应步骤，此步结束后应待管内液体冷却至室温后，方可进行下一步操作。

八是加热洗脱。在柱式提取时，为了提高洗脱效率，建议将活脱液加热到65℃左右再进行洗脱。因试剂盒附带的洗脱液一般含有EDTA成分，对后续扩增有一定影响，因此建议改用高压灭菌水洗脱。

3核酸扩增及结果分析

核酸扩增过程中应注意问题与提取过程类似，不再赘述。另外应注意：

一是混匀分装。对于非预分装的多组分试剂，在使用前应将所有试剂按需要量加在同一离心管内，混合均匀后瞬时离心，然后均匀分装到八联管内。在加入待检核酸后，同样需要瞬时离心才能放入设备扩增。

二是盖紧管盖。八联管在放入设备扩增前，一定要仔细检查是否盖紧管盖。如未盖紧，一是扩增过程中高温易使试剂蒸发，二是扩增产物会随水汽逸出污染设备加热模块。

三是产物处理。扩增后的八联管，应及时从设备中取出，投入带有含0.3%有效氯的消毒液中，转移至远离实验室的区域反应半小时以上，再作相应处理。

四是结果分析。屠宰企业所用的扩增设备，普遍采用固定阈值来判定结果，相对来说结果分析比较容易。

需要注意的有两点：

一是对于可疑样品如何处理？有的试剂盒规定，Ct值介于35~40的需进行再次检测，如仍出现典型的扩增曲线应判定为阳性。遇到此种情况，一定要对核酸进行再次检测！不能直接判定为阴性！

二是出现一定数量的高Ct值阳性样品如何处理？在经常检测非洲猪瘟的实验室，有时会出现一定比例的高Ct值阳性样品（Ct值35以下判定为阳性，出现20%以上Ct值30~35的样品），这时不能轻易结果为阳性！很可能是设备、环境受到污染，或者是试剂出了问题！可以参照环境消毒的内容，对实验台面及移液器进行消毒，再次提取核酸进行扩增，出现相同结果可更换另一种试剂进行再测，如还是出现相同结果，可判定为阳性。为慎重起见，也可将样品送至县、市兽医实验室，采用柱提法提取核酸进行扩增，查找出现阳性的原因。

4结果报告

如果检测过程发现阳性样品，一定要按照规定程序及时上报！不得瞒报、迟报、漏报！