盘龙七片是著名老中医、骨伤科专家王家成老先生所献祖传秘方,由盘龙七、壮筋丹、五加皮等29味中药组成,其具有活血化瘀、祛风除湿、消肿止痛的功效[1]。临床常用于治疗风湿性关节炎、腰肌劳损、软组织损伤、外伤性骨折等疾病。近年的研究显示,类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是盘龙七片目前治疗的主要疾病。盘龙七片曾被《卫生部药品标准中药成方制剂》收载(1998年版第二十册),其中列出了盘龙七片复方组成配比和制法以及性状、鉴别检查,且被中成药治疗类风湿关节炎临床应用指南推荐为治疗RA的临床用药。盘龙七片作为功效相对单一且临床疗效突出的中药复方代表,当前仍然存在一定质量控制方面的问题,《中国药典》2020年版也未收载对盘龙七片的质量控制方法。可见,当前盘龙七片质量控制方法需要进一步提升。因此,本研究根据质量标志物(quality markers,Q-Marker)的研究内涵[2-6],从中药成分与功效相关性角度,针对盘龙七片“祛风除湿”抗炎的主要功效,进行盘龙七片Q-Marker筛选。首先采用超高效液相-四极杆-飞行时间质谱联用(UPLC-QTOF-MS/MS)技术对盘龙七片化学成分进行表征,采用UPLC-MS/MS的MRM扫描模式建立化学成分同时定量方法;进一步结合前期网络药理学预测结果,分析候选“功效成分群”从“药材-成药”到“成药-入血”的动态转移情况,从中筛选转移率较高成分。然后采用分子对接技术,评价“功效成分群”与盘龙七片“祛风除湿”抗炎关键靶点的结合活性,最后通过偏最小二乘回归对“功效成分-体外活性”结果进行关联分析,将关联系数较高成分作为Q-Marker,以期为盘龙七片质量控制提供具有特有性、有效性、传递性的质控指标,保障其质量的有效追踪、溯源。
本研究从盘龙七片44
种化学成分中筛选出在“饮片-
成药-
入血”间转移能力较好,和“祛风除湿”关键靶点结合活性较高的6
个化合物作为盘龙七片主要功效相关的Q-Marker
:去氢木香内酯、龙胆苦苷、木香烃内酯、β-
蜕皮甾酮、迷迭香酸和染料木素。其中,去氢木香内酯是木香的主要成分,具有显著的抗炎活性,可以通过调控抑制核因子-κB
(nuclear factor-κB
,NF-κB
)/MAPK
和Nrf2-Hmox-1
通路,抑制白细胞介素(interleukin
,IL
)-1β
、IL-6
和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor
,TNF
)-α
水平[16]。龙胆苦苷是秦艽的主要成分,可以通过调控CD147/p38/NF-κB
通路抑制金属蛋白酶(metalloproteinases
,MMP
)分泌,从而减轻胶原诱导关节炎小鼠的滑膜炎症和软骨破坏程度[30]。β-
蜕皮甾酮是牛膝、重楼、壮筋丹的主要成分,有研究表明,以β-
蜕皮甾酮为主的组合物可显著恢复骨关节炎(osteoarthritis
,OA
)大鼠模型中的关节粘连、软骨损伤、滑膜组织病变,其机制与其对花生四烯酸通路中的炎症因子PGE2
,COX-2
水平的调控作用有关,同时,该组合物对关节液中的炎症因子CHI3L1
和IL-1β
也有较明显的抑制作用[31]。迷迭香酸是丹参的主要成分,具有广泛的药理作用,包括抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤和抗炎等。迷迭香酸可通过抑制炎性因子IL-1b
、IL-6
、IL-17
分泌;调控ADAMTS-4
、ADAMTS-5
、ACAN
、COL2
基因的表达来达到治疗RA
和OA
的作用[32]。另外,迷迭香酸还可以通过独立于Fas/Fas-
配体(FasL
)相互作用的线粒体途径诱导活化T
细胞(靶向T
细胞亚群CD3
+、CD25
+和CD4
+、CD25
+ T
细胞)和NK
细胞凋亡,进一步抑制炎性因子IL-17
释放,达到RA
治疗作用[33]。染料木素是杜仲Eucommia ulmoides Oliv.
的主要成分,可以通过抑制NF-κB
、前列腺素(prostaglandin
,PGs
)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase
,iNOS
)、促炎细胞因子和活性氧(reactive oxygen species
,ROS
)等多种信号通路具有较强的抗炎活性[34]。另有研究表明染料木素能通过Janus kinase 2
(JAK2
)/
转录激活因子3
(transcription activator 3
,STAT3
)通路呈剂量依赖性地抑制IL-6
和VEGF
的表达和分泌,从而抑制信号转导因子和STAT3
的核易位。此外,染料木素还能抑制IL-6
诱导的血管内皮细胞的迁移和血管形成,起到抗关节炎的作用[35]。本研究通过探索盘龙七片“功效成分群”在“饮片-
成药-
入血成分”间的动态循行规律,采用“Q-Marker-
体外生物活性”关联算法,建立从“功效成分群”到Q-Marker
的筛选策略。所选定的Q-Marker
可从“成分-
功效”角度为其整体质量提升及临床安全用药提供参考。