主题：【求助】求助标准加入法做法

标准加入法和 回收率法的区别
http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20060816/520669/


化学药物残留溶剂研究的技术指导原则
顶空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱标准加入法测定饮用水中的氯仿[/url]
顶空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱法测定氢钴胺中的丙酮溶剂残留[/url]

有机残留溶剂检查方法合理性评价的几点考虑 【转自临床药学讨论版】
原料药或制剂中有机溶剂的残留量一般要求控制在几个至几千个ppm之间，属于微量或痕量测定，与常量测定有着不同的特点 医学教 育网收集整理 。残留溶剂检查方法的选择对测定结果有着重要的影响，有时采用不同的方法测定同一个样品会得到截然不同的结果。通过对最近一段申报资料的审评，经常发现在残留溶剂的检查方法尚不合理的情况下，若样品的色谱图中未出现溶剂峰，也未经其它系统验证，研究者就简单地作出样品无该溶剂残留的结论，进而不将其残留定入质量标准，药检所也不再进行复核。针对这种情况，从审评的角度出发，就如何评价残留溶剂检查方法的合理性谈自己的一些认识，与各位业内同仁交流。  有机残留溶剂检查一般采用气相色谱法，评价色谱系统的适用性和方法学验证资料遵循与液相色谱方法评价相同的原则，不再赘述。与液相方法不同的是，气相色谱有多种进样方式，残留溶剂检查常用直接进样法或顶空进样法。针对这两种进样方法不同的特点，评价方法合理性的要点应有所不同。  对于直接进样法，应着重评价方法的灵敏度和重复性。目前已普遍用毛细管柱取代填充柱，因为毛细管柱的柱效高，其灵敏度也较填充柱大为提高。但由于毛细管柱直接进样的体积小，一般仅几微升，即使提高供试溶液的浓度，对于测定限量极低的溶剂（如：苯、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等）及对FID检测器响应低的溶剂（如：含氯的溶剂），其检测限一般接近或高于限量，灵敏度难以满足测定的需要。测定此类溶剂最好采用顶空进样法，对含卤素的溶剂可改用电子捕获检测器（ECD）。进样量小也易造成进样重复性差，采用内标法较外标法的结果更为准确。  顶空进样法是将大量样品中的残留溶剂富集在顶空瓶上层的气体中，对绝大多数有机溶剂而言，灵敏度较直接进样法大为提高，但顶空进样系统中存在气液两相的平衡问题，对结果准确性的影响因素增多。评价方法是否合理，应着重关注以下三个方面：（1）顶空条件：顶空瓶的平衡温度和时间是最重要的参数，根据溶解样品的溶剂和待测溶剂的不同性质，达到气液平衡所需的温度和时间可能不同，应有试验数据作为选择的依据，但在申报资料中一般都未提及。判断顶空条件是否适用，一般的规律是：顶空瓶的平衡温度应低于溶解样品所用溶剂的沸点10℃以下，能满足检测灵敏度即可；对于沸点过高的溶剂，如DMF、DMSO、聚乙二醇等，用顶空进样测定的灵敏度不如直接进样，不适宜采用顶空法；顶空瓶的平衡时间一般应为30至60分钟，才能保证气液两相达到稳态平衡。（2）供试品和对照品是否平行：由于供试品和对照品的液体部分状态不完全一致而造成的基质效应会直接影响到结果的准确性。采用标准加入法可以消除基质效应，但目前在国内的申报资料中较少见到，其原因可能是方法较为繁琐，且需要消耗大量的样品，对新药研发初期样品量较少的情况或一些贵重的药品不太适用。如果申报资料中提供了回收率数据，就容易判断基质效应的大小，但由于目前对此没有强制要求，大多数资料都未对回收率进行研究。因此在评价方法时，至少应要求对照品和供试品采用相同的溶剂溶解，且液体部分的体积应完全一致。（3）重复性：由于顶空进样法存在气液平衡和气体进样的问题，粗放度较大，中国药典2005年版的要求是：内标法连续五次进样的相对标准偏差小于5％，外标法的相对标准偏差小于10％；欧洲药典则要求相对标准偏差小于15％，因此重复性应密切关注。  此外，无论是直接进样或顶空进样，都应尽量使供试液中的样品完全溶解，否则当残留溶剂被包裹在样品晶格中时就不能被检测出来，可能造成结果与实际情况完全不符。对溶解性差的样品，可采用不挥发性酸或碱的溶液、高沸点的有机溶剂、混合溶剂等来溶解样品，即使样品在加热的条件下可能被破坏，只要待测的残留溶剂不被破坏（如：测定酯类溶剂不能采用酸或碱溶液，以免发生分解）且样品的热分解产物不影响测定，那么方法也是可以认可的。如果确实有一些药物采用上述条件都不能达到溶解，则可考虑采用充分研磨或超声的方法破坏药物的结构，使其中的残留有机溶剂释放出来，当然，这种情况下一般应注意进行相应的方法学验证以确定方法的可行性。  在国外药典中，对残留溶剂检查的规定有所不同，其中以欧洲药典对残溶检查的要求最为严格，它建立了两个极性不同的色谱系统，对色谱系统的选择、色谱条件、溶液的配制方法、系统适用性试验、方法学验证等都作了详细的规定，以保证样品中所有的残留溶剂都能被逐一的、准确的检测出来，避免发生遗漏的情况；根据样品的具体情况选用其中一个系统测定后，还必须用另一系统加以验证，以保证结果的正确性。欧洲药典的残溶检查方法看似繁琐、呆板，但在其严谨、严格的框架下，结果的可信度、准确度、专属性、耐用性大大提高，值得我们研发者和评价者共同借鉴。  以上为个人在工作和学习过程中的一些体会，希望与大家一起讨论，共同提高。

残留溶剂检查方法的选择和验证要点
http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20070118/716079/
食用植物油中溶剂残留量的顶空气相色谱标准加入法测定研究
<<江西化工>>2006年 第04期
作者: 辜雪英
顶空气相色谱标准加入法测定自来水中的一溴二氯甲烷和二溴一氯甲烷
<<色谱>>2005年 第23卷 第02期
作者: 王永华,

什么是标准加入法？

答：标准加入法是一种被广泛使用的检验仪器准确度的测试方法。这种方法尤其适用于检验样品中是否存在干扰物质。

将一定量已知浓度的标准溶液加入待测样品中，测定加入前后样品的浓度。加入标准溶液后的浓度将比加入前的高，其增加的量应等于加入的标准溶液中所含的待测物质的量。如果样品中存在干扰物质，则浓度的增加值将小于或大于理论值。

顶空气相色谱法测定卡维地洛中有机溶剂残留
作者：彭洁，洪建文，魏雪芳    作者单位：（广东省药品检验所，广东 广州 510180； 广东省药品审评认证中心，广东 广州
【摘要】  目的 建立同时测定卡维地洛中乙醚、丙酮、 四氢呋喃、乙酸乙酯、甲醇、苯、三氯甲烷、甲苯、二氧六环、1，2二氯乙烷残留量的方法。方法 采用顶空气相色谱法测定卡维地洛中有机溶剂残留量，使用Agilent DBWAX毛细管柱；以氮气为载气；以FID为检测器。结果 该法有良好的线性，r在0.9971～0.9998之间；精密度试验及重现性试验RSD值均小于6％，平均回收率在89.0％～100.9％之间。结论 该方法简便，快速，准确，可用于卡维地洛的乙醚、丙酮、 四氢呋喃、乙酸乙酯、甲醇、苯、三氯甲烷、甲苯、二氧六环、1，2二氯乙烷残留量的测定。

【关键词】  卡维地洛；顶空气相色谱法；有机溶剂残留量

　　卡维地洛（carvedilol）为心血管类药物，可阻断α及β受体，无内在活性，其阻断β受体的作用较强，适用于原发性高血压及心绞痛。国内不同的合成工艺采用不同的有机溶剂，需用到的有机溶剂有乙醚、丙酮、 四氢呋喃、乙酸乙酯、甲醇、苯［1］、三氯甲烷、甲苯、二氧六环、1，2二氯乙烷［2］，根据《中国药典》2005年版二部对药物有机溶剂残留量和ICH的要求，应对这些有机溶剂都进行控制。但目前各生产厂家均根据自己的生产工艺，仅对生产中涉及的溶剂进行检查，没有针对该品种统一的有机溶剂检测方法。本文建立了顶空气相色谱法同时检测上述十种有机溶剂的残留量，可适用于各厂家不同工艺的卡维地洛残留溶剂质量控制。

　　1  仪器与试药
   
　　Agilent 6890N气相色谱仪，Agilent G1888A顶空自动进样器，Sartorius CP225D万分之一电子天平。
   
　　乙醚（20061101-11）、丙酮（20060910-2）、乙酸乙酯（20060602-2）、甲苯（20060405-2）、二氧六环（20020201）、冰醋酸（20060401-2）均是分析纯，均是广州化学试剂厂产品；四氢呋喃（941907）、甲醇（020225）、三氯甲烷（041108）均是气相参比物，均是天津化学试剂二厂产品；苯（分析纯，天津市永大化学试剂开发中心，2006年8月13日）；1，2二氯乙烷（分析纯，天津市百世化工有限公司，2004年7月10日）；乙腈（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司，061025101）；以上试剂纯度均≥99.0%；实验用水为超纯水。卡维地洛（由不同厂家提供，A、B、C、D共4批）。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件
   
　　色谱柱：Agilent DBWAX毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.5 μm）；氢火焰离子检测器，检测器温度：230 ℃，进样口温度200 ℃；载气：氮气；流速：3.0 mL/min；柱温：程序升温，起始温度40 ℃，保持12 min，以40 ℃/min的升温速率升至180 ℃保持5 min;顶空瓶温度：90 ℃，顶空时间：30 min;进样体积：1 mL。

　　2.2  溶液的制备

　　2.2.1  对照品溶液的配制
   
　　分别取甲醇、丙酮、四氢呋喃、二氧六环适量，精密称定，加质量分数为20％的冰醋酸溶液制成含甲醇3 mg/mL、丙酮5 mg/mL、四氢呋喃0.72 mg/mL、二氧六环0.38 mg/mL的贮备溶液①。再分别取1，2二氯乙烷、苯、三氯甲烷、甲苯、乙醚、乙酸乙酯加乙腈分别制成含1，2二氯乙烷0.05 mg/mL、苯0.02 mg/mL、三氯甲烷0.6 mg/mL、甲苯8.9 mg/mL、乙醚50 mg/mL、乙酸乙酯50 mg/mL作为贮备液②。取贮备溶液①10.0 mL和贮备溶液②1.0 mL加质量分数为20％醋酸的溶液至100 mL量瓶，取2.0 mL置20 mL顶空瓶中，作为对照品溶液。

　　2.2.2  供试品溶液的配制
   
　　精密称取供试品约0.2 g，置20 mL顶空瓶中，精密加入质量分数20％的醋酸溶液2.0 mL，作为供试品溶液。

　　2.3  线性范围的确定
   
　　分别取“2.2.1”项下对照品贮备溶液①4.0 mL和贮备溶液②0.4 mL、贮备溶液①8.0 mL和贮备溶液②0.8 mL、贮备溶液①10.0 mL和贮备溶液②1.0 mL、贮备溶液①12.0 mL和贮备溶液②1.2 mL、贮备溶液①16.0 mL和贮备溶液②1.6 mL加质量分数为20％的醋酸溶液至100 mL量瓶。取2.0 mL置20 mL顶空瓶中，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积（A）为纵坐标，以质量浓度（ρ）为横坐标，得出线性关系。结果见表1。

　　表1  线性关系结果（略）

　　Tab.1  The result of linear range

　　2.4  干扰试验
   
　　取空白溶液（质量分数为20％的醋酸溶液），按“2.1”项下色谱条件测定。结果表明空白溶液对样品测定无干扰，色谱图中各溶剂的保留时间如下:乙醚（1.239 min）,丙酮（2.056 min）,四氢呋喃（2.520 min）,乙酸乙酯（2.847 min）,甲醇（3.101 min）,苯（3.851 min）,三氯甲烷（6.286 min）,甲苯（6.896 min）,二氧六环（8.109 min）,1，2二氯乙烷（8.471 min）,冰醋酸（14 min）,见图1。

　　2.5  重复性试验
   
　　按“2.2.1”制备对照品溶液，取6份进样测定。测得乙醚、丙酮、 四氢呋喃、乙酸乙酯、甲醇、苯、三氯甲烷、甲苯、二氧六环和1，2二氯乙烷RSD依次为2.1％，0.9％，1.2％，1.3％，2.1％，0.9％，1.6％，1.8％，2.3％和2.8％（n＝6），表明试验的重复性良好。

　　2.6  加样回收率试验
   
　　取已知有机残留量的供试品约0.1 g置20 mL顶空瓶，加入相当于“2.2.1”项下对照品溶液浓度80％，100％，120％的溶液2.0 mL，按本方法进行试验，考察其加样回收率。平均回收率（n＝9）按乙醚、丙酮、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲醇、苯、三氯甲烷、甲苯、二氧六环、1，2二氯乙烷顺序依次为97.1％（RSD＝4.2％），96.6％（RSD＝4.9％），93.6％（RSD＝2.9％），99.5％（RSD＝2.6％），100.9％（RSD＝5.7％），89.0％（RSD＝3.0％），100.2％（RSD＝3.2％），98.7％（RSD＝4.2％），96.0％（RSD＝5.0％），97.3％（RSD＝4.5％）。

　　图1  20％冰醋酸溶液（A）、对照溶液（B）、供试品溶液（C）的gc色谱图（略）

　　Fig.1  gc chromatograms of blank solvent (20%Acetic acid )(A)、chemical reference substance(B)、sample(C)

　　2.7  卡维地洛中有机溶剂残留量的限量和检出限
   
　　根据《中国药典》2005年版二部附录对药物中残留溶剂的限量作了明确规定，以质量分数计，乙醚不得过0.5％，丙酮不得过0.5％，四氢呋喃不得过0.072％，乙酸乙酯不得过0.5％，甲醇不得过0.3％，苯不得过0.0002％，三氯甲烷不得过0.006％，甲苯不得过0.089％，二氧六环不得过0.038％，1，2二氯乙烷不得过0.0005％［3］。采用上述色谱方法，将混合对照品溶液逐步稀释，直至未检测到明显的峰为止，其检出限为乙醚0.025 μg/mL，丙酮0.05μg/mL，四氢呋喃7.3×10-3 μg/mL，乙酸乙酯0.05 μg/mL，甲醇3×10-4 μg/mL，苯1×10-3 μg/mL，三氯甲烷0.6 μg/mL，甲苯8.6×10-5 μg/mL，二氧六环1.6 μg/mL，1，2二氯乙烷0.1 μg/mL。

　　2.8  样品测定
   
　　取供试品3批，按“2.2.2”项下方法制备，依法测定，按外标法计算。4厂样品乙醚、丙酮、四氢呋喃、甲醇、苯、三氯甲烷、二氧六环、1，2二氯乙烷均未检出；乙酸乙酯的残留量均为0.1％；A、B、D厂甲苯量未检出，C厂甲苯量为0.01％。

　　3  讨论

　　3.1  取“2.2.1”项下对照品溶液进行直接进样和顶空进样进行对比，发现顶空进样各峰间分离良好，杂质较少，且直接进样对色谱柱的伤害较大，所以顶空进样明显优于直接进样。

　　3.2  对溶解供试品的溶剂进行考察，醋酸浓度为低于20％时，样品不能很好溶解；浓度太高则对色谱柱具较大伤害。同时，曾试用二甲基亚砜溶解供试品，虽然供试品能很好溶解，但在苯、1，2二氯乙烷等出峰的位置上也出现杂质峰，考虑其质量情况，故不选用。经考察，质量分数为20％的醋酸溶液为最佳溶剂。

　　3.3  分别使用Agilent DB1、Agilent HP5、Agilent DB624等不同极性的毛细管柱，均不能把这十种残留溶液完全分离。而Agilent DBWAX能将其分离，并且柱效、峰型以及保留时间良好。

　　3.4  分别使用不同品牌聚乙二醇毛细管柱，不同品牌气相色谱仪，对同一批样品进行测定，其结果基本一致。表明该方法耐用性良好。

　　3.5  本法可在18 min、同一色谱条件下检测10种不同有机溶剂的残留量，简便快捷。可用于卡维地洛有机残留溶剂的测定。

【参考文献】
  　　［1］ 顾红.药物合成过程中有机溶剂残留量的检测［J］.天津化工，2004，18（6）：53-54.

　　［2］ 黄丽玫，陈红红，颜戊利，等.顶空气相色谱法测定尿中1，2二氯乙烷［J］.广东药学院学报，2006，22（6）：667-668.

　　［3］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部［S］.北京：化学工业出版社，2005.

谢谢大家的帮助，很有用呢！