主题：【原创】关于分光光度计基线校正的原理和方法

原文由 叶子(xiaoanxiaoye) 发表:
请教一个问题，我用双光束紫外分光光度计测量，“在参比位及样品位上都放上参比”，意思是说每个样品位上都放一个参比液吗？是不是如果我需要同时测5个样品的话，就得放5个参比，然后基线校准啊？因为我在实验过程中遇到这么个问题，我只在参比池和1号样品池中放置了参比液，进行校准后，放入1、2、3号样品池中样品，测量，结果1号的数据和2、3号的两数据不同，为什么出现这样的情况啊？

原文由 夕阳(anping) 发表:
对于双光束分光光度计而言在使用前必须要做基线校正（也称为基线记忆），对于此项工作的原理和操作方法许多使用者的认识不尽相同；为此谈谈我的认识。
（一）为何要做基线校正？
众所周知、光度计的光学系统基本是由光源（氘灯、钨灯）—单色器（光栅、狭缝）—检测器（光敏二极管、光电倍增管）等三部分组成的。在我们使用的波长区域中（一般紫外可见仪器均在190nm～1100nm范围里，）上述部件在不同的波长下的响应值（光源的发射强度、单色器的色散强度、检测器的放大倍数）均不相同；通俗地说、即使没有样品，仪器如果不做基线校正，那么在190nm至1100nm的范围中，吸光值或透过率不会是一条直线，这是一种客观的物理现象，如下图；


尽管上图反映的是单光束的能量图，但在基线未校正状态下，即使改用双光束测量方式来扫描一个样品，其所得到的图谱或吸光值也是不可信的。
（二）被校正的基线种类和用途
（1）系统基线：
所谓系统基线就是仪器固有的波长范围的总基线；例如一台仪器出厂设计的波长全程范围是190nm至1100nm，那么它的系统基线就是这个范围。一般来讲，作为分析人员对一台仪器做全程扫描测试是比较少见的；之所以要做系统基线的目的一般是将仪器的光学系统的响应值校正到基本一致；这就类似马拉松赛跑一样，只要大家在同一起跑处（注意：不是起跑线）比赛，前后差几米出发无所谓。
（2）用户基线：
所谓用户基线就是分析者自己设定的测量波长区域的一段基线；由于这是分析所需要的区域，为了保证测试的准确性，故用户基线的校正是非常重要和必要的；这就类似百米赛跑一样，运动员要在同一个起跑线上比赛而不能抢跑，否则无法准确计算成绩。
（三）基线校正的方法
（1）系统基线：
系统基线的校正较为简单，一般情况下样品室内不放样品，仅做光学系统的校正；如果一定要使用全波段的测量那另当别论。同时需要注意的是：系统基线无需经常校正，一般半个月或一个月校正校正一次即可。对有的仪器来说，系统基线校正过于频繁反而会造成基线漂移严重。
（2）用户基线校正：
正确的校正方法是：两只比色杯盛有空白溶液分别放置在样品及参比光路中，校正波长范围要大于分析波长范围；例如、分析设定范围为220nm～500nm，那么校正波长就要设定为210nm～510nm；等待校正结束后再将波长设定回到原来的220nm～500nm范围。这种校正方法的优点是：如果校正波长与分析波长完全吻合一致，有可能在校正后的基线两端出现大的噪声；如果校正范围大于实际分析范围并掐头去尾后可以提高分析精度。我将这种校正方法起名为“豆芽菜原理”，目的是便于记牢；（因为我们吃豆芽菜时均要掐头去根，仅吃中间部分，故以前的饭馆将炒豆芽这道菜称为“炒掐菜”；对不起、跑题了）。关于这种校正方法，许多使用者往往不知晓或忽略掉了，在此顺便介绍给版友。
值得注意的是，有的仪器操作者在做基线校正时，参比一侧不放参比溶液，也就是用空气来做参比对照。这种方法在可见区对有的样品也许有时影响不大，但在紫外区影响就会很明显了。严格的说，用空气做参比所测得的结果不是真正意义上的校正光谱。
（四）基线校正的注意事项
（1）基线校正时要保证仪器有一定的预热时间
（2）每更换一种参比溶液后均要重新做基线校正
（3）如果参比溶液的吸光度大于样品的吸光度值时测试结果会出现负值，此时要考虑使用何种溶液做基线校正了。
（4）做基线校正时要考虑试剂的使用波长范围问题，因为有的试剂在某个波长以下的吸光度值会无限大，这时去做校正会超出仪器的有效量程范围，无法得到真正的结果。关于试剂的使用波长范围，目前一般在试剂瓶的标签上会有标注。我有个简单资料表供大家参考如下：