主题：【转帖】常见致病微生物的检测

EHEC O157:H7检验程序图解

检样25g

↓

　　　　　　mEC225mL → VIDAS快速筛选

　　↓41±1℃，18-24h

10-4，10-5，10-6稀释度涂布TC-SMAC

↓36±1℃，18-24h

挑取5-10个可疑菌落接种MUG-LST

↓36±1℃，18-24h

MUG阴性培养物转种普通营养琼脂

↓ 　　　　↓

生化反应鉴定 　　　血清凝集鉴定

　　　　　　　或

　　　　　　　　　胶乳凝集试验

　　用上述方法在样品中分离获得的纯菌落，经抗E.coli O157:H7标准血清或EHEC O157:H7胶乳凝集测试为阳性者，报告检出肠出血性大肠杆菌O157:H7。

　　如需要进一步检测Vero毒素基因的存在，可通过接种Vero细胞或Hela细胞，观察细胞病变进行判定，或可使用基因探针检测和聚合酶链反应（PCR）检测法。（参见FDA细菌分析手册第8版）

表1：EHEC O157:H7部分生化反应特性

靛基质（吲哚）试验
阳性

MR-VP试验
MR阳性 VP阴性

枸橼酸盐利用试验
阴性

氧化酶试验
阴性

三糖铁琼脂
底及斜面黄色，H2S-

纤维二糖发酵
阴性

山梨醇发酵
阴性或迟缓发酵

赖氨酸脱羧酶
阳性（紫色）

鸟氨酸脱羧酶
阳性（紫色）

棉子糖发酵
阳性

卫矛醇发酵
阳性

西蒙氏柠檬酸盐
阴性

鼠李糖发酵
阳性

MUG试验
阴性

动力试验
有动力或无动力

表2： EHEC O157:H7与大肠埃希氏菌有鉴别意义的生化特性

试验项目
E.coliO157:H7

（174株）%
大肠埃希氏菌

（974株）%
（1887株）%

MUG
0
96
NT

山梨醇
0
95
80

棉子糖
100
20
49

卫矛醇
100
50
49

赖氨酸
100
92
81

鸟氨酸
100
74
58




[注] NT为未检测，表内数字为阳性率。

五、控制

　　适宜的蒸煮，适当的储存温度，个人卫生教育，防止粪便污染动物胴体是控制出血性大肠杆菌污染的主要措施。

金黄色葡萄球菌及检验


一、生物学特性

　　典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。

二.流行病学

　　金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：

　　季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：

　　食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。

　　肠毒素形成条件：

　　存放温度，在37°C内，温度越高，产毒时间越短；

　　存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；

　　食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。

三.致病性

　　金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F五种血清型。肠毒素可耐受100°C煮沸30分钟而不被破坏。它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。

四.检验和控制

1．金黄色葡萄球菌的检验

　　样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。

　　增菌培养：将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24小时。

　　分离培养：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37°C培养24-48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。

　　染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0.5-1μm。

　　血浆凝固酶试验：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。

　　耐热核酸酶试验：将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，36±1°C培养24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。本试验金黄色葡萄球菌为阳性。

2．金黄色葡萄球菌肠毒素检测

　　金黄色葡萄球菌肠毒素的检测主要有动物试验、血清学试验、免疫荧光试验及酶联免疫吸附等方法，在此就不一一赘述。

3．金黄色葡萄球菌的控制主要包括：

　　1）防止金黄色葡萄球菌污染食品

　　防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。

　　防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至-10℃以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。

　　对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。

　　2）防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成

　　应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过6小时，并且食用前要彻底加热。

沙门氏菌及检验

　　人沙门氏菌病有四类综合症：沙门氏菌病；伤寒；非伤寒型沙门氏菌败血症和无症状带菌者。沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，通常表现为轻度，持久性腹泻。伤寒实际上是由伤寒沙门氏菌所致。未接受过治疗的病人致死率可超过10%，而对经过适当医疗的病人其致死率低于1%，幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。这些无症状携带者不显示发病症状仍能将微生物传染给其他人(传统的例子就是玛丽伤寒)。

　　非伤寒型沙门氏菌败血症可由各型沙门氏菌感染所致，能影响所有器官，有时还引起死亡。幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。

一、致病性

　　沙门氏菌胃肠炎，潜伏期一般6-72小时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般1-2天或更长。感染剂量为15-20个菌，死亡率达1-4%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。污染源主要是人和家畜的粪便，沙门氏菌常存在于动物中，特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品中，包括生肉，禽，奶制品和蛋，鱼，虾和田鸡腿，酵母，椰子，酱油和沙拉调料，蛋糕粉，奶油夹心甜点，顶端配料，干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克力。

　　沙门氏菌属也是嗜温性细菌，在中等温度，中性pH，低盐和高水活度条件下生长最佳。生长最低水活度为0.94。兼性厌氧，对中等加热敏感。同样，该菌属能适应酸性环境。通过卫生以防止二次污染；蒸煮；巴氏消毒等控制。正常家庭烹调，个人卫生可以防止煮熟食品的二次污染，以及控制时间和温度一般都能充分防止沙门氏菌病的发生。

二、检验

　　因沙门氏菌是最常见的食源性细菌病原体，因此在本节中重点介绍沙门氏菌的检验。沙门氏菌是食物传播病原菌中研究最活跃的细菌。从食品中分离和鉴定沙门氏菌，当前通用的方法学分5个步骤：

　　1.前增菌-第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。

　　2.选择性增菌-在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。

　　3.选择性平板分离-这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。

　　4.生物化学筛选-排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。

　　5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。

　　这五个步骤代表理想状况。不过一个有经验的检验员，可能在一个或几个步骤中看出特性和差别。

　　目前检验食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础，25g食品为标准分析单位。

三、从食品中分离沙门氏菌样品的制备

　　下面的方法是以25g样品为检测单位，样品：肉汤为1∶9的比例。除非另有说明，根据混合程度，加足够的肉汤保持1∶9的比例。对不需准确称量检测的样品，例如：田鸡腿，可参看特定方法说明。

1、干蛋黄、干蛋白、干全蛋、液奶（去脂牛奶，含2%脂肪牛奶，全脂奶，和脱脂奶）、粉状调制食品（蛋糕，甜饼，炸面圈，饼干和面包）、婴儿食品、口食或软管进食含蛋的食品：

　　检验前的冷冻样品最好不要解冻。如果冷冻样品必须软化以获取待检测部分，则尽可能迅速的解冻所需部分，使竞争菌数少增加或降低沙门氏菌的可能损伤。解冻需在45℃以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2�5℃，18小时内解冻。无菌操作称取25g样品，放入灭菌带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。非粉状的样品，加入225mL灭菌乳糖肉汤。如果制品是粉状，加入约15mL灭菌乳糖肉汤，用灭菌玻璃棒，匙或灭菌压舌器搅拌，使成均匀悬液。再加3份乳糖肉汤10mL，10mL，190mL，使总量为225mL。充分搅拌，直到样品完全悬浮没有团块为止。盖紧瓶盖在室温静置60min。振摇使充分混匀，用试纸测定pH值。必要时用灭菌的1NNaOH或1NHcl调节pH至6.8±0.2。在测定最终pH前要盖紧瓶盖并充分混匀。然后将瓶盖旋松约1/4圈，置35℃培养24±2小时。以下步骤按四，1-10进行。

2、蛋类：

　　A、含壳蛋：用硬刷子在水流下刷洗蛋。把蛋在含0.1%十二烷酸磺酸钠（SDS）的200ppm氯离子溶液中浸泡30min。加8mL 5.25%次氯酸钠到含1g SDS的992mL蒸馏水中，制备200ppm cl-/0.1%SDS溶液。这种消毒剂需在使用前临时制备。无菌操作打开蛋，使用灭菌的蛋分离器，弃去蛋白。无菌操作称取25g蛋黄到灭菌的500mL锥型瓶或其他合适容器内。加225mL胰胳胨（胰化物）大豆肉汤（TSB），并振荡充分混匀。在室温下静置60分钟。振摇使其充分混匀，用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2，置35℃培养24±2小时，以下步骤按四，1-10继续。

　　B、液全蛋（均状）：无菌操作称25g置于无菌的500mL锥形烧瓶或其它合适容器中。加225mLTSB并振荡充分混匀。按上面所述继续。

　　C、煮硬的蛋（鸡蛋，鸭蛋或其他蛋类）：目前，不知道蛋白中的沙门氏菌抑制因子是否具有热稳定性。因此，无菌操作分离蛋白和蛋黄。称取25g粉状蛋黄固体到无菌500mL锥型瓶或其他合适容器中。加225mLTSB并旋转充分混匀。按上面所述继续。

3、脱脂乳粉

　　A、速溶：无菌操作称取25g样品，加入灭菌烧杯（250mL）或其它合适容器内。经灭菌玻璃或纸质（用带卷好以备高压灭菌）漏斗，往灭菌的500mL锥形烧瓶或其它合适容器中（装有225mL煌绿水），缓缓倾注25g检测单位，使其覆盖在煌绿水表面。也可将多份25g检验单位按比例 倒入相应份数的煌绿水表面。按每1000mL灭菌蒸馏水中加1%煌绿溶液2mL配置煌绿水。将盛有样品�前增菌培养基的容器静置60±5分钟。松松地盖上容器盖，不需要混合或调节pH值，于35℃培养24±2小时，以下步骤按四，1-10继续。

　　B、非速溶：按上述A脱脂乳粉的方法进行，只不过不允许将多份检验单位按比例合并检验。

4、全脂奶粉：

　　无菌操作称取25g样品，加入无菌的，带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。加入225mL灭菌蒸馏水并振荡充分混匀。盖紧在室温下静置60分钟。使其充分混匀，用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。在测定最终pH前要盖紧瓶盖并充分混匀。然后加0.45mL1%的煌绿染液并充分混匀。旋松瓶盖约1/4转后，置35℃培养24±2小时，以下步骤按四，1-10继续。

5、酪蛋白：

　　无菌操作称取25g样品，加入无菌均质杯中，加225mL灭菌乳糖肉汤到样品中并匀质2分钟。无菌操作，把已匀质的混合物转移到灭菌，带螺旋帽的500mL广口瓶或其他合适的容器内。盖紧盖子在室温下静置60分钟。振摇使充分混匀，用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。在测定最终pH前要盖紧瓶盖并充分混匀。旋松瓶盖约1/4圈后，置35℃培养24±2小时，以下步骤按四，1-10继续。

6、大豆粉：

　　无菌操作称取25g样品，加入灭菌烧杯（250mL）或其它合适容器内。用灭菌玻璃或纸质（用带卷好以备高压灭菌）漏斗，往装有225mL乳糖肉汤的灭菌的500mL锥形烧瓶或其它合适容器中，缓缓倾注25g检测单位，使其覆盖在乳糖肉汤表面。检测单位（25g）不可多份按比例混合检测。容器静置60±5分钟。松松地盖上容器盖，不需要混合或调节pH值，于35℃培养24±2小时，以下步骤按四，1-10继续。

7、含蛋制品（面条，蛋卷，通心粉，意大利面条）、干酪、生面团、调制色拉（火腿，蛋，鸡肉，金枪鱼，火鸡）、新鲜的、冷冻的、或干的水果和蔬菜、果仁、甲壳类动物（小虾，蟹，小龙虾，LANGOSTINOS，龙虾）和鱼：

　　检测前冷冻样品最好不要解冻，如果冷冻样品必须软化以取其检测部分，则要在持续搅拌并带有自动调温器控制的45℃水浴内15分钟内解冻。或者在2�5℃18小时内进行。

　　无菌操作称取25g样品，加入灭菌的均质器中。加入225mL灭菌的乳糖肉汤并均质2分钟。再无菌操作转移已均质的混合物到无菌的带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。盖紧瓶盖，于在室温下静置60分钟。振摇使其充分混匀，用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。充分混匀。旋松瓶盖约1/4转后，置35℃培养24±2小时，以下步骤按四，1-10继续。

8、干酵母：

　　无菌操作称取25g样品，放入灭菌带螺旋帽的广口瓶中（500mL），或其他合适的容器内。加入225mL灭菌胰酪胨（胰化）大豆肉汤，充分混匀使酵母形成均匀悬液。盖紧瓶盖于在室温下静置60分钟。振摇使其充分混匀，用试纸测定pH值。必要时，调节pH值至6.8±0.2，在测定最终pH前要混合充分。旋松瓶盖约1/4转后，置35℃培养24±2小时。非活性干酵母，以下步骤按D，1-11进行。活性干酵母，混匀经培养过的样品，转种1mL到10mL月桂基蛋白（LST）中，另转种1mL到10mL四磺酸盐（TT）肉汤中。将此两种选择性肉汤于35℃培养24±2小时。充分地旋转混合经培养过的增菌肉汤，每种肉汤都要用3mm接种环划线接种3个选择性平板（四，3和四，4），接下面的四，5�10进行。

9、食品上霜和上顶用的混合物：

　　无菌操作称取25g样品，放入灭菌，带螺旋帽的广口瓶或其他合适的容器中。加入225mL营养肉汤并充分混合。盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。振摇使其充分混匀，用试纸测定pH值。必要时，调节pH值至6.8±0.2。旋松瓶盖约1/4转后，置35℃培养24±2小时。以下步骤按四，1-10继续。

10、调味品：

　　A、黑胡椒、白胡椒、芹菜籽或者干辣椒粉、小茴香、红辣椒、欧芹片、迷迷香、芝麻、麝香草、蔬菜片：无菌操作称取25g样品，放入灭菌带螺旋帽的广口瓶或其他合适的容器中。加入225mL灭菌胰酪胨大豆（TSB）肉汤，充分混匀，盖紧瓶盖于在室温下静置60分钟。旋动混匀，用试纸测定pH值。必要时，调节pH值至6.8±0.2。旋松瓶盖约1/4转后，置35℃培养24±2小时。以下步骤按四，1-10继续。

　　B、洋葱片、洋葱粉、大蒜片：无菌操作称取25g样品，放入灭菌带螺旋帽的广口瓶或其他合适的容器中。将样品于含K2SO3的TSB胰酪胨大豆肉汤（1000mLTSB加5g K2SO3使K2SO3的最终的浓度为0.5%）中进行前增菌。添加K2SO3于肉汤中。分装225mL于500mL锥形瓶中，经121℃高压灭菌15分钟。灭菌后无菌操作测定容量，必要时再调整至225mL。将225mL含K2SO3的无菌TSB加入样品中，充分混匀。接下去按三，10A节进行。

　　C、牙买加胡椒、桂皮、丁香及薄荷：目前还没有方法可以中和这四种香料的毒性。将香料稀释至无毒的程度，再进行菌检。检验牙买加胡椒，桂皮和薄荷时，样品与肉汤比例为1∶100，而丁麝香样品与肉汤比例为1∶1000。检查叶状的调味品，因遇到脱水的制品，可吸收肉汤这一实际困难，其样品与肉汤比例要大于1∶10。检查这些调味品按三，10A描述的方法进行，保持推荐的样品与肉汤的比例。

11、糖果与糖衣（包括巧克力）：

　　无菌操作称取25g样品放入灭菌的搅拌容器中。加入225mL灭菌的调配脱脂乳粉，搅拌2分钟。再无菌操作转移搅拌过的混合物到灭菌带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。转动混匀，用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。再加入0.45mL1%煌绿染液混匀，将瓶盖旋松1/4转后培养。以下按四，1�10节进行。

12、椰子：

　　无菌操作称取25g样品放入灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。加入225mL灭菌的乳糖肉汤，振摇后，盖紧瓶盖在室温下静置60分钟，再振摇使其充分混匀，用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。总计加入2.25mL已蒸过（15分钟）的阴离子特吉托尔7号，并充分混匀。可用已蒸过（15分钟）的三硝基甲苯X�100来代替。这些表面活性剂限制使用最小量，使之刚刚起泡沫即可。三硝基甲苯X�100大约2或3滴。旋松瓶盖约1/4转后，置35℃培养24±2小时。以下步骤按四，1-10继续。

13、食用染料与食用色素：

　pH6.0或以上的染料（10%悬浮液），按上述干全蛋方法（C�1）处理。沉淀染料或pH低于6.0的染料，无菌操作称取25g样品，放入灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。加入225mL不含煌绿染料的四硫磺酸盐肉汤混匀。盖紧瓶盖在室温下静置60分钟，用pH计调节pH值至6.8±0.2。再加入2.25mL0.1%的煌绿溶液，充分旋动混匀。旋松瓶盖约1/4转后，置35℃培养24±2小时。接下去按下面的四，3�10节进行。

14、明胶：

　　无菌操作称取25g样品，放入灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。加入225mL灭菌的乳糖肉汤和5mL5%明胶酶水溶液。混合均匀，盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。转动混匀，用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。将瓶盖旋松1/4转，置35℃培养24±2小时。以下按四，1�10节进行。

15、肉、肉代用品、肉副产品、动物产品、腺体制品和粗粉（鱼，肉，骨）：

　　无菌操作称取25g样品放入灭菌的搅拌器中。加入225mL灭菌的乳糖肉汤，搅拌2分钟。再无菌操作转移已搅拌的混合物到灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。如果混合物为粉状，研磨过或已粉碎的，则不用搅拌。不需要搅拌的样品，加入乳糖肉汤，并充分混匀；盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。旋动使充分混匀，用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。总计加入2.25mL已蒸过（15分钟）的特吉托尔阴离子7号，混匀。也可用已蒸过（15分钟）的三硝基甲苯X�100来代替。控制使用这些表面活性剂剂量，刚刚起泡沫即可。实际用量取决于试验材料的成分；分析粉状腺体制品，不需要用表面活性剂。将瓶盖旋松1/4转后，将样品混合物置35℃培养24±2小时。以下按四，1�10节进行。

16、田鸡腿（此方法用于国内的和国外的所有田鸡腿检验）：

　　将15对田鸡腿放入灭菌塑料袋内，并用灭菌乳糖肉汤浸没。如果单个腿估计平均重在25g或以上，则只需检查15对的每对中的一条腿。把袋放入大塑料烧杯内或其它合适的容器中，在机械荡器上震荡15min，以4cm（1-1/2in）机械振荡100次/分钟。从袋中倾倒出乳糖肉汤于另一个灭菌塑料袋内。加更多的乳糖肉汤，使总量为3500mL。充分混匀，于室温下静置60分钟。必要时调节pH值至6.8±0.2。再把装有乳糖肉汤的塑料袋放入塑料烧杯或其它合适的容器内，于35℃培养24±2小时。接下去按下面的四，1�10节进行。

17、野兔骨架（此方法用于国内的和国外的所有的野兔骨架）：

　　取3只野兔骨架放入灭菌塑料袋内，并用灭菌乳糖肉汤浸没（见上述A，23�25节），把袋放入大塑料烧杯内或其它合适的容器中，在机械震荡器上以4cm（1-1/2in）幅度振荡100次/分钟，震荡15min。从袋中倾倒出乳糖肉汤混合物于另一个灭菌塑料袋内，加更多的乳糖肉汤，使总量为3500mL。充分混匀，于室温静置60分钟。必要时用pH试纸调置6.8±0.2，于35℃培养24±2小时。接下去按下面的四，1�10节进行。

18、口香糖：

　　无菌操作称取25g样品到灭菌烧杯（250mL）或其他合适容器中。制备过滤除菌的1.0%纤维素酶溶液（加1g纤维素酶到99mL无菌水中），用0.45um膜过滤除菌，置于150mL瓶中。（纤维素酶溶液在2·-5℃可保存最长2周时间）。加入225mL无菌乳糖肉汤和2.25mL无菌1%纤维素酶溶液于500mL无菌带螺旋盖的广口瓶或其他合适容器。用磁力搅拌器剧烈搅拌酶/肉汤混合物时，通过无菌玻璃漏斗迅速倒入25g待检样品。旋好瓶盖，室温下静置60分钟，无须调pH值。旋松瓶盖，35℃培养24±2小时。以下按四进行。

四、沙门氏菌的分离

　　1、拧紧瓶盖并轻轻振荡培养过的样品混合物。

　　生鲜食物、严重污染的食品和动物饲料：

　　转移0.1mL混合物到10mLRAPPAPORT�VASSILIADIS（RV）肉汤培养基中，另转移1mL混合物到10mL四硫磺酸盐肉汤（TT）中。

　　其它食品：

　　转移1mL混合物到10mL亚硒酸盐胱氨酸肉汤（SC）中，另转移1mL混合物到10mL四硫磺酸盐肉汤（TT）中。

　　2、选择性增菌按如下步骤进行：

　　生鲜食品、严重污染的食品和动物饲料：

　　RV培养基在42±0.2℃（水溶）中培养24±2小时。TT肉汤在43±0.2℃（水溶）中培养24±2小时。

　　其它食品：

　　SC和TT肉汤在35℃培养24±2小时。

　　3、混合均匀（如果是试管，涡旋式混合），用3mm直径的接种环，满环（10μl）划线接种TT肉汤于亚硫酸铋（BS）琼脂，木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂和HEKTOEN氏肠道菌（HE）琼脂平板上。BS琼脂平板于划线接种的前一天制备好储存在室温暗处。

　　4、再用3mm直径的接种环， 从RV培养基（样品为生鲜食物，严重污染的食品和动物饲料）和SC肉汤（除了生鲜食物，严重污染的食品和动物饲料以外其它样品）取满环（10μl），划线接种于上述平板上。

　　5、把选择性平板置35℃培养24±2小时。

　　6、检查平板中可疑沙门氏菌菌落的存在。

　　典型的沙门氏菌菌落形态：

　　从每个经过24±2小时培养后选择性平板上挑 取2个或更多个菌落。典型的沙门氏菌菌落如下：

　　A、在HEKTOEN氏肠道菌（HE）琼脂上。

　　菌落呈兰绿至兰色，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的光泽黑色中心或几乎全部黑色的菌落。

　　B、在木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂上。

　　粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可有大的光泽黑色中心或呈几乎全部黑色的菌落。

　　C、亚硫酸铋（BS）琼脂上。

　　呈褐色，灰色或黑色，有时带有金属光泽。菌落周围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有所谓的晕环效应。

　　如果典型菌落出现在经24±2小时培养后的BS琼脂上，则挑取2个或更多个典型菌落。不论BS琼脂平板在培养24±2小时时是否挑取过菌落，BS平板再培养24±2小时。培养了48±2小时后，如果BS平板上出现典型菌，则挑取2个或更多个菌落，如果只在经过24±2小时培养的BS平板上挑取了菌落，接种到三糖铁琼脂（TSI）和赖氨酸琼脂（LIA）上，会呈现非典型反应以至视为培养物中不存在沙门氏菌 。参见下面四.8部分和四.9部分，有关TSI和LIA反应的详细描述。

非典型的沙门氏菌菌落形态：

　　不存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。

　　A、HE和XLD琼脂：

　　非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。HE和XLD平板经24±2小时培养后，没有典型的沙门氏菌菌落，则挑取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。

　　B、BS琼脂：

　　某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平板培养24±2小时后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落，让平板继续培养24±2小时。如果经48±2小时培养后，仍没有典型或可疑的菌落出现，则挑取2个或更多个非典型的菌落。

　　7、用灭菌接种针轻轻地接触每个菌落中心部位，接种TSI斜面，先在斜面上划线，再于底层穿刺。不需灼烧接种针，即可接种LIA斜面，先穿刺接种底层两次，再划线斜面上。由于赖氨酸脱羧反应需严格厌氧条件，因而LIA斜面必须有深的底层（4cm）。将已挑过菌落的选择性平板于5�8℃储存。

　　8、将TSI和LIA琼脂斜面于35℃分别培养24±2小时。当进行斜面培养时放松试管帽以保持需氧条件，以防止过量的H2S产生。

　　在TSI琼脂中，典型的沙门氏菌培养物使斜面呈碱性（红色），底层呈酸性（黄色），产生或不产生H2S（琼脂变黑色）。在LIA琼脂中，典型的沙门氏菌培养物其试管底层呈碱性（紫色）反应。只有试管底层呈明显黄色时才认为有酸性（阴性）反应。不要单纯根据其试管底层产生的褪色反应就排除它。在LIA中，大多数沙门氏菌培养物皆产生H2S；一些非沙门氏菌培养物产生砖红色反应。

　　9、在LIA琼脂上所有底层呈碱性反应的培养物，无论其在TSI琼脂上反应如何，皆应全部保留为可疑的沙门氏菌分离物，并进一步做生化和血清学试验。在LIA中呈酸性底层反应和在TSI中呈斜面碱性，底层酸性的培养物，均视为可疑的沙门氏菌分离物，应进一步做生化和血清学试验。在LIA中呈酸性底层和在TSI中呈酸性斜面和酸性底层的培养物，可视为非沙门氏菌培养物而弃去。对所保留的拟定阳性TIS琼脂培养物，可按下面四，10节叙述的进行检测，是否为沙门氏菌，包括亚利桑那沙门氏菌。如果TSI中培养物没有呈现沙门氏菌的典型反应（斜面碱性，底层酸性），再从未拟定阳性的选择性平板上另外挑取可疑菌落，象上面四，7节所述的接种TSI和LIA斜面。

　　10、生化和血清学鉴定试验：

　　a从亚硒酸盐胱氨酸肉汤（或相应食品的RV培养基）划线分离的选择性琼脂平板上所挑取的3个拟定阳性TSI琼脂培养物和从四硫磺酸盐肉汤划线分离的选择性平板所挑取的3个拟定阳性TSI琼脂培养物，进行生化和血清学鉴定试验。

　　b如从一组选择性琼脂平板未分离出3个拟定阳性的TSI琼脂培养物，则对其它已分离到的拟定阳性的TSI琼脂培养物进行生化和血清学鉴定试验。对所分析的每个25g样品，至少应检查6个TSI培养物。