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液相色谱（LC）

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主题：【第二届网络原创参赛作品】液相色谱之玩法-正相色谱

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发表于：2009/10/17 19:24:53 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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本来准备写凝胶色谱,因为最近为了把液相改成GPC，做了不少准备，计划已经交上，但最近终于找到用氯仿体系的GPC，因此改造暂缓，先外送测定。对自己来说工作是轻松了，不过文章也泡汤了。在家无事，想起06年作正相的事，还是有些值得回味的地方，应该改得差不多了

前言
我虽然接触液相年头也不短了，各种稀奇古怪的样品也作了不少，但回想起来，真正用的时间以一天8小时计，不知道有没有三个月，连操作工都不算，只能算玩票性质。不过这不是我的错，机器比我还闲呢，看到它布满灰尘地静静躺在角落，心中总有无限感概。
想起学校的时候，老师想要个自己的液相色谱，就是因为钱不够直到退休也没实现。可是在我们这儿，它似乎成了一堆废物，是真的吗？记得04年我们的安捷伦1100刚装不久，最简单配置：二元泵和可变波长检测器，好像是二十多万的样子。有个样品课题组送出去做，人家说样品溶解性不好，建议正相色谱作。听说我们买了液相色谱，便跑来问分析室领导是不是可以做，领导说我们是反相色谱，做不了。我人微言轻，不过从心里真的很为仪器不值。06年终于有个样品要用液相分析，是合成的固体纯品看大致看看纯度，用反相色谱测定，面积归一法定量，毫无挑战性可言。后来想连续监控反应过程，要我测体系中的该物质，但反应体系接触水或空气催化剂平衡很快就被破坏，测定数据不能反映反映真实情况（这时我根据液相的两次进样差别判断出来的），于是在课题组的支持下，玩了一把正相色谱。
各人情况不同，本文其实没什么代表性，只给和我差不多情况的人作参考。
1.有较多的时间，包括人和机器：如果一大堆样子等着你或仪器是时间没办法玩的
2.没有人指导也无文献可借鉴：按别人的方法做一遍，不叫玩，叫移植或验证方法
3.对名利不要考虑太多：不做自然不会有问题，但是既然你选择了要做，就要自己承担后果，包括你的责任或是老天爷的责任。

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2009/10/17 19:25:29 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1.硬件之改造
同是液相色谱色谱，有卖凝胶色谱、离子色谱的，没听说过卖正相色谱、反相色谱的，可见一般的液相色谱本来就是正反色谱都可以做的。
不过安捷伦的液相色谱如果没有特别指明，它的活塞密封圈是不耐正己烷的，需要更换。(据说岛津的不用换,不知道是否确实?)
从硬件来说换个密封圈就行了，不过因为我样品特殊性，我在进样方面也动了一些脑筋。
1.1柱塞密封圈

图中黑色的通用的密封圈，是原来仪器上的，有人说拆下来不能用了，但我还是小心的留着，没准可以应急（好像1千多块1个）。黄色的是聚四氟乙烯的密封圈，正反都可以用,就是耐压低点。边上灰色的是我们一台20几年前的岛津液相色谱的备件，那是一台应该说很不错的仪器，但没怎么用就报废了，我看了真是很心疼的，不过处理废品时只要仪器不要备件，所以配件我都藏起来了，可惜除了管路以外，能够用的东西并不多。真可惜了密封圈，直到机器报废还没开封，而我又用不上。
拆的过程我当时没拍，就借用安捷伦资料里的几张图，我也是看着它做的，把泵头上连接线、螺丝拆了，泵头取下来，活塞杆拉出来，把密封圈拿出来（很不幸我的密封圈不在活塞杆上，而传说中用活塞杆把它挑出来的技术我也不行，是用镊子把它硬拽出来的），把要换的密封圈套在活塞上推进去。拆的时候紧张的不行，生怕活塞杆被我碰断或者划伤，还好最后一切顺利。换好以后别忘了把最高限压改成200bar。

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2009/10/17 19:25:51 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1.2 取样进样方式改造
改用正相色谱后，目标样品还是没出来，然后想是不是氧气的影响更严重。原来的测定方式是用流动相稀释以后进样，虽然这个过程我用了通氮方式，但从放料到取样管、吸取、稀释定容、抽取进样这么多过程要做到完全隔氧那是不可能的事。设计过管路在线直接稀释通入六通阀的方案，但终因要改造的东西牵涉的方面比较多（不是每个人都喜欢玩的），最后就采取了以下方式，终于得到了合理的数据。
a). 放料口改用气相进样垫密封，采用可换针头的气体进样针配以长针头扎入进行洗针和取样。
b). 六通阀原有的20微升定量环换成自制的小体积定量环。
c). 抽取样品后立刻用废弃的气相进样垫堵死送到液相色谱测试，测试前换上液相针头进样。
通过这样方式基本隔绝了空气的影响，由于不稀释，用小定量管定量可以让峰型变得好一点。
下面是几张图

我的私藏：割刀、peek管，从色谱配件公司买的三无产品，定量环割得短了点，安装容易绷断，最好选用更细内径可以割长点，不过手头没有，只好将就这用了。

上面是单独买的注射用针头，用于抽取反应液的;下面是搞液相色谱都有的进样针头。中间是四氟柱塞杆的气体进样针（0.5ml,上海高鸽的，尾巴掉了），针头可以旋上去，比较紧密，选用这个的原因是因为玻璃注射针不密封，从后面漏液，一次性针筒又会被腐蚀，同时采用定量环定量因此对针筒刻度准确性要求不高。用这个价格不贵，用的也不错。顺便说一句，在用于气相色谱认为它配的针太粗（这里我没用到，看起来就像注射用针头），而且可换针头死体积大，还是用的固定针头好。

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2009/10/17 19:27:26 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

3.色谱柱和流动相
我们好马却没好鞍，没有正当理由买耗材还是很困难的。我这个又没现成方法，连相关资料也没有。只有看看别人作正相色谱的配置资料，色谱柱五花八门很多，本来想买根硅胶柱就行了。后来听人家说，硅胶柱怕水、寿命短、峰形不好（以上均未证实），最后一咬牙选了一根氰基柱，当时有两种想法，一当然是想用来作正相色谱，二来万一失败，我还可以拿它当反相色谱柱用，看着我们气相色谱各种柱子备了一堆，而液相就是一根C18柱，多根不同的柱子玩玩也好。一询价跟C18柱差不多（本来以为用的不多的柱子会贵一些），就买了根进口的25cm的氰基柱，2千多点，是贵是便宜都不重要，估计以后也不会买了。
反相流动相我是水和甲醇（乙腈备了，但用的不多）打天下，一看资料中人家正相色谱用的：正己烷、环己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、异丙醇、叔丁醇等等太多了，就算领导批准我HPLC级的一样买一瓶，我怎么去试验搭配？最后还是跟几个同行请教了一下，采用了正己烷和异丙醇，正己烷相当于甲醇，异丙醇相当于水，一开始先用正己烷洗脱，然后调高异丙醇比例看分离情况，最后确定个梯度条件，总体来说不错。
从正相换成反相是要考虑流动相的替换的,我这个体系当然最好的是用异丙醇缓冲,但异丙醇黏度大,100%进色谱柱柱压太高，所以拆下原来的柱子，用PEEK管短接，用异丙醇整个系统走一走，换上色谱柱，再用50%正己烷和50异丙醇走一遍，然后提高正己烷的比例。

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2009/10/17 19:28:17 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

4.样品的出峰规律
这个从所有的书上都可以查到，反相色谱是极性强的先出峰，正相是极性强的后出峰，这样的话正相色谱出峰和反相色谱相反。理论归理论，实际并非如此，我这个样品中目标检测物在反相上的顺序是甲苯、A、B、C，在正相上是甲苯、C、B、A，都是甲苯最早出来，也搞不清到底在这甲苯的极性是强是弱。不过作为分析人员来说，这个问题并不十分重要，毕竟是用标样来定位置而不是理论来定位置。

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2009/10/17 19:28:44 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

5.一个实际的例子
上面的例子就本身解决问题重点是改进了进样方式，而并不是正相色谱的功劳，后来我用同样的进样方式在反相色谱上也获得成功（纯乙腈流动相，C18柱），可以这么讲，用正相色谱是多走了弯路，但让我有了一次用正相色谱的机会。课题结束了，色谱仪也休息了，最近我一个样品倒是真正需要正相色谱作的，又去小试了一把，仪器也比较争气，被闲置了这么久，还没闹情绪。
这个是一个二元酸酯参与的反应体系，一直用气相色谱分析，现在怀疑里面是不是有二元酸，让我测测看。如果不是这个体系中，该二元酸有用反相色谱测的资料，流动相以酸性缓冲溶液的水为主配以少量的甲醇，但在这个体系，二元酯遇水会水解为单酯直至酸，同时二元酸是最早出来的，若减少流动相中水含量，二元酸的小峰会淹没在大量的其它物质所掩盖。
这是我做的反应液的色谱图