主题:【第二届网络原创参赛作品】液相色谱之玩法-正相色谱

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wanttofly
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本来准备写凝胶色谱,因为最近为了把液相改成GPC,做了不少准备,计划已经交上,但最近终于找到用氯仿体系的GPC,因此改造暂缓,先外送测定。对自己来说工作是轻松了,不过文章也泡汤了。在家无事,想起06年作正相的事,还是有些值得回味的地方,应该改得差不多了




前言
我虽然接触液相年头也不短了,各种稀奇古怪的样品也作了不少,但回想起来,真正用的时间以一天8小时计,不知道有没有三个月,连操作工都不算,只能算玩票性质。不过这不是我的错,机器比我还闲呢,看到它布满灰尘地静静躺在角落,心中总有无限感概。
想起学校的时候,老师想要个自己的液相色谱,就是因为钱不够直到退休也没实现。可是在我们这儿,它似乎成了一堆废物,是真的吗?记得04年我们的安捷伦1100刚装不久,最简单配置:二元泵和可变波长检测器,好像是二十多万的样子。有个样品课题组送出去做,人家说样品溶解性不好,建议正相色谱作。听说我们买了液相色谱,便跑来问分析室领导是不是可以做,领导说我们是反相色谱,做不了。我人微言轻,不过从心里真的很为仪器不值。06年终于有个样品要用液相分析,是合成的固体纯品看大致看看纯度,用反相色谱测定,面积归一法定量,毫无挑战性可言。后来想连续监控反应过程,要我测体系中的该物质,但反应体系接触水或空气催化剂平衡很快就被破坏,测定数据不能反映反映真实情况(这时我根据液相的两次进样差别判断出来的),于是在课题组的支持下,玩了一把正相色谱。
各人情况不同,本文其实没什么代表性,只给和我差不多情况的人作参考。
1.有较多的时间,包括人和机器:如果一大堆样子等着你或仪器是时间没办法玩的
2.没有人指导也无文献可借鉴:按别人的方法做一遍,不叫玩,叫移植或验证方法
3.对名利不要考虑太多:不做自然不会有问题,但是既然你选择了要做,就要自己承担后果,包括你的责任或是老天爷的责任。
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wanttofly
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1.硬件之改造
同是液相色谱色谱,有卖凝胶色谱、离子色谱的,没听说过卖正相色谱、反相色谱的,可见一般的液相色谱本来就是正反色谱都可以做的。
不过安捷伦的液相色谱如果没有特别指明,它的活塞密封圈是不耐正己烷的,需要更换。(据说岛津的不用换,不知道是否确实?)
从硬件来说换个密封圈就行了,不过因为我样品特殊性,我在进样方面也动了一些脑筋。
1.1柱塞密封圈

图中黑色的通用的密封圈,是原来仪器上的,有人说拆下来不能用了,但我还是小心的留着,没准可以应急(好像1千多块1个)。黄色的是聚四氟乙烯的密封圈,正反都可以用,就是耐压低点。边上灰色的是我们一台20几年前的岛津液相色谱的备件,那是一台应该说很不错的仪器,但没怎么用就报废了,我看了真是很心疼的,不过处理废品时只要仪器不要备件,所以配件我都藏起来了,可惜除了管路以外,能够用的东西并不多。真可惜了密封圈,直到机器报废还没开封,而我又用不上。
拆的过程我当时没拍,就借用安捷伦资料里的几张图,我也是看着它做的,把泵头上连接线、螺丝拆了,泵头取下来,活塞杆拉出来,把密封圈拿出来(很不幸我的密封圈不在活塞杆上,而传说中用活塞杆把它挑出来的技术我也不行,是用镊子把它硬拽出来的),把要换的密封圈套在活塞上推进去。拆的时候紧张的不行,生怕活塞杆被我碰断或者划伤,还好最后一切顺利。换好以后别忘了把最高限压改成200bar。

wanttofly
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1.2 取样进样方式改造
改用正相色谱后,目标样品还是没出来,然后想是不是氧气的影响更严重。原来的测定方式是用流动相稀释以后进样,虽然这个过程我用了通氮方式,但从放料到取样管、吸取、稀释定容、抽取进样这么多过程要做到完全隔氧那是不可能的事。设计过管路在线直接稀释通入六通阀的方案,但终因要改造的东西牵涉的方面比较多(不是每个人都喜欢玩的),最后就采取了以下方式,终于得到了合理的数据。
a). 放料口改用气相进样垫密封,采用可换针头的气体进样针配以长针头扎入进行洗针和取样。
b). 六通阀原有的20微升定量环换成自制的小体积定量环。
c). 抽取样品后立刻用废弃的气相进样垫堵死送到液相色谱测试,测试前换上液相针头进样。
通过这样方式基本隔绝了空气的影响,由于不稀释,用小定量管定量可以让峰型变得好一点。
下面是几张图

我的私藏:割刀、peek管,从色谱配件公司买的三无产品,定量环割得短了点,安装容易绷断,最好选用更细内径可以割长点,不过手头没有,只好将就这用了。

上面是单独买的注射用针头,用于抽取反应液的;下面是搞液相色谱都有的进样针头。中间是四氟柱塞杆的气体进样针(0.5ml,上海高鸽的,尾巴掉了),针头可以旋上去,比较紧密,选用这个的原因是因为玻璃注射针不密封,从后面漏液,一次性针筒又会被腐蚀,同时采用定量环定量因此对针筒刻度准确性要求不高。用这个价格不贵,用的也不错。顺便说一句,在用于气相色谱认为它配的针太粗(这里我没用到,看起来就像注射用针头),而且可换针头死体积大,还是用的固定针头好。
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3.色谱柱和流动相
我们好马却没好鞍,没有正当理由买耗材还是很困难的。我这个又没现成方法,连相关资料也没有。只有看看别人作正相色谱的配置资料,色谱柱五花八门很多,本来想买根硅胶柱就行了。后来听人家说,硅胶柱怕水、寿命短、峰形不好(以上均未证实),最后一咬牙选了一根氰基柱,当时有两种想法,一当然是想用来作正相色谱,二来万一失败,我还可以拿它当反相色谱柱用,看着我们气相色谱各种柱子备了一堆,而液相就是一根C18柱,多根不同的柱子玩玩也好。一询价跟C18柱差不多(本来以为用的不多的柱子会贵一些),就买了根进口的25cm的氰基柱,2千多点,是贵是便宜都不重要,估计以后也不会买了。
反相流动相我是水和甲醇(乙腈备了,但用的不多)打天下,一看资料中人家正相色谱用的:正己烷、环己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、异丙醇、叔丁醇等等太多了,就算领导批准我HPLC级的一样买一瓶,我怎么去试验搭配?最后还是跟几个同行请教了一下,采用了正己烷和异丙醇,正己烷相当于甲醇,异丙醇相当于水,一开始先用正己烷洗脱,然后调高异丙醇比例看分离情况,最后确定个梯度条件,总体来说不错。
从正相换成反相是要考虑流动相的替换的,我这个体系当然最好的是用异丙醇缓冲,但异丙醇黏度大,100%进色谱柱柱压太高,所以拆下原来的柱子,用PEEK管短接,用异丙醇整个系统走一走,换上色谱柱,再用50%正己烷和50异丙醇走一遍,然后提高正己烷的比例。
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4.样品的出峰规律
这个从所有的书上都可以查到,反相色谱是极性强的先出峰,正相是极性强的后出峰,这样的话正相色谱出峰和反相色谱相反。理论归理论,实际并非如此,我这个样品中目标检测物在反相上的顺序是甲苯、A、B、C,在正相上是甲苯、C、B、A,都是甲苯最早出来,也搞不清到底在这甲苯的极性是强是弱。不过作为分析人员来说,这个问题并不十分重要,毕竟是用标样来定位置而不是理论来定位置。
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5.一个实际的例子
上面的例子就本身解决问题重点是改进了进样方式,而并不是正相色谱的功劳,后来我用同样的进样方式在反相色谱上也获得成功(纯乙腈流动相,C18柱),可以这么讲,用正相色谱是多走了弯路,但让我有了一次用正相色谱的机会。课题结束了,色谱仪也休息了,最近我一个样品倒是真正需要正相色谱作的,又去小试了一把,仪器也比较争气,被闲置了这么久,还没闹情绪。
这个是一个二元酸酯参与的反应体系,一直用气相色谱分析,现在怀疑里面是不是有二元酸,让我测测看。如果不是这个体系中,该二元酸有用反相色谱测的资料,流动相以酸性缓冲溶液的水为主配以少量的甲醇,但在这个体系,二元酯遇水会水解为单酯直至酸,同时二元酸是最早出来的,若减少流动相中水含量,二元酸的小峰会淹没在大量的其它物质所掩盖。
这是我做的反应液的色谱图

可以看出整个反应体系东西很多,基本集中在6分钟之前,6.9分钟为单酯,14.4分钟为二元酸,证明确实体系中确实含有二元酸,不过含量较低。从图谱来说二元酸峰型有些拖尾,不过它是最后出来的,周围很干净,没有其它峰干扰,无论作鉴定还是定量都还不错。
柏坡
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