主题：【求助】液相法检测三聚氰胺标准品出现双峰的原因

一个原因是柱子损坏了，一个原因是用盐做三聚氰胺，注意清洗柱子的方法。

1. 同样的样品，同样的条件老柱子出双峰，新柱子单峰，说明标准品和硬件都没有问题。而且过去通过清洗柱子可以消除此现象，现在清洗不起作用。说明最大可能是柱子污染（因为一般来说流动相和滤头污染的概率小的多）。
2. 从峰形看（双峰中有前一个峰展宽很大），有2种可能：1. 柱子上的残留经过长时间冲洗，在这个时间被洗下来了；2. 色谱柱已经被污染物（基质中引入的杂质，如脂肪、蛋白等）饱和吸附了，后面再做样品时，杂质不会再被柱子吸附而被洗下来，由于该杂质保留较强，通常是上一针的杂质因保留时间太长，在下一针，甚至下下一针流出来了。
3. 随着色谱柱的使用，各种不可预知的杂质吸附会导致柱子的清洗会越来越困难。通常需要增大流动相强度来增强清洗效果。如果楼主只是用过甲醇清洗柱子，那么建议楼主依次试一下下述流动相：100%乙腈，0.05%三氟乙酸的纯乙腈，0.1%三氟乙酸的纯乙腈，二氯甲烷等，这些流动相都可以用低流速（0.2 ml/min）过夜的方法。需要注意的是：a. 如果使用带三氟乙酸的流动相，色谱柱最好是耐酸性的，如果说明书说您的柱子耐受的pH只能到2，则冲洗时间不要超过30分钟；b. 使用二氯甲烷冲洗时要先用甲醇或异丙醇过度一下，因为二氯甲烷和水不互溶。

    由于食品基质的复杂性，还有一种常见情况是检测器或进样器污染。一般可以将流通池或进样器（手动，自动进样器最好在线清洗）拆下来先在蒸馏水中超声清洗后再转入异丙醇溶液中超声清洗，清洗时间10-30分钟，视污染情况而定，如果楼主能定期（周期视检测量而定，检测量越大，周期越短）清洗，则可每次清洗十分钟。另一种方法是在线状态下用大流速的水清洗（确保盐被彻底清洗干净）后再用乙腈大流速冲洗。如果检测器或流通池污染十分严重，还可以用10-50 mM的NaOH或硝酸水溶液清洗，非常有效。需要注意的是：管路要全用不锈钢的，清洗时间不要超过30分钟，这样比较安全。

原文由 kangli-1688(kangli-1688) 发表:
使用岛津的LC-20A，C18的色谱柱检测三聚氰胺，新柱子使用一段时间标准品的峰就出现双峰，应该是柱子脏了，把柱子清洗一下，再小流速反冲一下，就好了，吸滤头也一月超洗一次，流动相全部过0.22的膜，样品也过0.22的膜，但是还是出现这现象，也不知是哪个地方清洗不到位，请有经验的指导一下，谢谢，见附图，红圈的为标准品峰

1. 同样的样品，同样的条件老柱子出双峰，新柱子单峰，说明标准品和硬件都没有问题。而且过去通过清洗柱子可以消除此现象，现在清洗不起作用。说明最大可能是柱子污染（因为一般来说流动相和滤头污染的概率小的多）。
2. 从峰形看（双峰中有前一个峰展宽很大），有2种可能：1. 柱子上的残留经过长时间冲洗，在这个时间被洗下来了；2. 色谱柱已经被污染物（基质中引入的杂质，如脂肪、蛋白等）饱和吸附了，后面再做样品时，杂质不会再被柱子吸附而被洗下来，由于该杂质保留较强，通常是上一针的杂质因保留时间太长，在下一针，甚至下下一针流出来了。
3. 随着色谱柱的使用，各种不可预知的杂质吸附会导致柱子的清洗会越来越困难。通常需要增大流动相强度来增强清洗效果。如果楼主只是用过甲醇清洗柱子，那么建议楼主依次试一下下述流动相：100%乙腈，0.05%三氟乙酸的纯乙腈，0.1%三氟乙酸的纯乙腈，二氯甲烷等，这些流动相都可以用低流速（0.2 ml/min）过夜的方法。需要注意的是：a. 如果使用带三氟乙酸的流动相，色谱柱最好是耐酸性的，如果说明书说您的柱子耐受的pH只能到2，则冲洗时间不要超过30分钟；b. 使用二氯甲烷冲洗时要先用甲醇或异丙醇过度一下，因为二氯甲烷和水不互溶。

        由于食品基质的复杂性，还有一种常见情况是检测器或进样器污染。一般可以将流通池或进样器（手动，自动进样器最好在线清洗）拆下来先在蒸馏水中超声清洗后再转入异丙醇溶液中超声清洗，清洗时间10-30分钟，视污染情况而定，如果楼主能定期（周期视检测量而定，检测量越大，周期越短）清洗，则可每次清洗十分钟。另一种方法是在线状态下用大流速的水清洗（确保盐被彻底清洗干净）后再用乙腈大流速冲洗。如果检测器或流通池污染十分严重，还可以用10-50 mM的NaOH或硝酸水溶液清洗，非常有效。需要注意的是：管路要全用不锈钢的，清洗时间不要超过30分钟，这样比较安全。

可以肯定是柱子脏了,或是试样有杂质，但找出原因很难，这需要检测测量过程的环节，以及仪器。

谢谢bonna-agela及各位指导，目前经过长时间的乙腈、水梯度清洗，效果好多了，可能就是流路系统有堵得地方，如发现压力、保留时间等有较大变化时，应加强清洗的同时，对单向阀，进样器之类进行超声清洗，最好定期维护，平时清洗到位。

你换个新柱子看看，要是标样可以的话，就说明柱子问题啊，看你图谱，明显是柱效差了，柱子导致的峰形分叉，看你的峰宽要1min多了。

还有就是看峰面积阿，原来峰形好的时候的峰面积和你现在这两个峰的峰面积和，是不是一致，一样的话说明，现在的情况是柱子不好，导致分叉而出现两个峰。如果现在这两个峰的峰面积比原来高，那可能有杂质为分离开，标样重配再走。


不过我看了图谱，应该还是柱子坏了，导致分叉，出现你所谓的"两个峰"

用正向的HILIC柱吧，出峰很好的，也不需要离子对试剂

应该是柱子不行了吧，换新的吧

柱子不行了，要想色谱柱的使用寿命比较长，日常维护最关键

是进样量的问题。我确定。