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主题：【分享】定量PCR 选择：荧光探针与荧光引物

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pfz1985

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2010/6/17 7:26:14 11楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

应用：应用于基因定量分析和突变体识别、疾病基因检测与诊断、单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism , SNP) 分析等生物医学基础和临床研究中。

优点：本底低，特异灵敏

缺点：①杂交时探针不能完全与模板结合，因此稳定性较差。

② 探针合成时标记较复杂

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2010/6/17 7:27:42 12楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

延伸技术：建立在分子信标技术基础上的探针技术有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion等，其中

Sunrise技术，这一方法的特点是所有的扩增产物均能标记上荧光分子，因此荧光信号响应快，但无法区分特异和非特异扩增是其致命的不足。

Amplisensor技术是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接一淬灭物。两探针长度不同，其中淬灭物标记探针5’端多出7个碱基（GCGTCCC）。PCR扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式PCR引物连接，PCR引物的5’末端应有一段与长探针互补的序列，以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探针－引物复合物作为半套式引物掺入到模板，从而释放出淬灭探针部分，破坏了FRET，而产生荧光。

Scorpion技术（蝎形引物）则是通过在分子信标的3’端设计连接臂连接一段引物，使PCR延伸反应时不能够延伸至分子信标，这样非特异扩增产物便无荧光信号。包含发夹结构的PCR产物在退火时形成分子内杂交，发夹结构被破坏，两个基团之间发生荧光共振能量转移，从而发出荧光。这种方法可以解决非特异的问题，同时灵敏度高，反应快，已应用于k-ras及BRAC2基因的突变分析了，但这种方法不能保证杂交时探针与模板完全匹配，而且合成复杂。
这种技术虽然也是积累荧光（因为结合上模板以后不会掉下来），但是不同于Taqman水解探针，分子信标可以进行溶解曲线分析，这也就是说分子信标可以进行包括突变检测，SNP检测等在内的定量PCR延伸应用。但是这种技术正如上面提到的探针设计复杂，稳定性差——而这一点对于溶解曲线的影响颇大，因此在应用上也需要审慎考虑。　

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2010/6/17 7:28:25 13楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

第三代：荧光引物
Amplifluor技术
原理：激发的荧光进行分子能量转移到受体成分导致荧光发射的淬灭。目标特异性Amplifluor引物包含一个5’内部互补序列，标记有荧光发色团（fluorescerin）和一个能量受体：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。发夹结构的3’端序列是目标特异性引物区。未结合的Amplifluor引物由于内部荧光发色团和淬灭分子的紧密接近，只有低的荧光信号。

在第一个循环中，Amplifluor引物1与特异CDNA的第一条链退火并被Taq酶延伸。在第二个循环中 Amplifluor引物1延伸产物作为引物2（反义链引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor发夹引物解折叠并产生荧光信号。随后的扩增循环中产生的荧光信号的增强与扩增产物量的增加成比例。

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2010/6/17 7:28:55 14楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

LUX技术
原理：LUM(light upon extention) 引物技术是Invitrogen公司的一项专利，是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。使用类似分子信标的发夹结构设计引物，使引物同时起到荧光探针的作用。引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。使用LUX引物，不需要专门设计探针，即省了成本又给实验设计提供了宽松的条件。由于没有探针控制特异性，因此他的特异性要弱于探针技术，但非特异性扩增或引物二聚体没有影响，所以其特异性要强于SYBR　GREEN。

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