主题:【分享】WATERS高效液相的标准操作规程(SOP)

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WATERS高效液相的标准操作规程(SOP   



1 流动相的处理

1.1 过滤溶剂

溶剂在使用前一定要用0.5μm的过滤器过滤,如果使用固体化学试剂(缓冲盐)配制流动相,过滤特别重要,不能让固体微粒污染泵,阻塞进样器和柱头过滤片。本实验室有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择(反光面朝上),过滤水溶性流动相时(如甲醇/水),先用1-2ml甲醇润湿过滤膜,有助于快速抽滤。

1.2 保持储液瓶的清洁

用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子,最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗,不能在清洗过程中留下污迹。

1.3 保证溶剂的质量

一定要用HPLC级的溶剂,水也应达到HPLC级,同样也要使用高纯度的缓冲盐。

1.4 故障及解决方法

1.4.1 流动相脱气不充分

流动相受热,或者流动相不同组分混合时会有气体产生,气泡进入泵内引起压力波动,增加噪音,色谱图上出现毛刺。可试用下列方法解决问题:流动相再脱气;采用更有效的脱气方法或两种方法配合使用;改系统内混合为系统外预混合。

1.4.2 流动相供给不畅

流动相用完,管道中吸入气体引起泵压力不稳。应经常观察储液器中流动相的量,加足流动相保证所有的样品分析完毕。输液管道上装沉子沉至瓶底,储液器盖上留一小孔正好夹住进液管,使其不能上下移动。

过滤器阻塞引起管道和泵腔空化,压力不稳。过滤器被微粒所阻塞或长霉,去掉过滤器后如果系统运转正常,说明已找出问题,换上新的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅,那就需要查查流动相的制备过程,或者换大孔径的过滤器。不管如何,流动相都需要重新过滤。

流速过高阻力大,造成空化现象,这是由于过滤器孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于10ml/min,常会出现这种现象。使用下列方法解决:(1)使用低流速;(2)换大孔径的过滤器;(3)增加进液管道内径;(4)抬高或加压储液器;(5)不用过滤器,但流动相一定要先过滤;(6)储液器盖子太紧,在储液器内形成真空,打出的流动相不连续。应松开盖子或留有1mm的缝隙;(7)进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液,注意调整进液管道或更换新的。其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等,都能引起供液不正常。

1.4.3  流动相和储液器被污染

由于污染,噪音越来越大,检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统,而再以稳定的浓度流出来,所以在色谱图中不出多余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶,流动相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突然增大或突然提高,都是因为反复加进新的流动相或系统用得太久(通宵)所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉,繁殖了细菌。

脏的储液器会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储液器,或者定期报废储液器。

流动相污染来自这几个方面:试剂质量不高,玻璃器皿不合格;微生物的影响;配制流动相时操作不当等。因此要求高纯度化学试剂和HPLC级溶剂。玻璃器皿按规定清洗干净。为防止微生物生长,每天要用甲醇清洗系统。怀疑系统内生长了微生物,可用稀硝酸冲洗既可(注意不要损坏柱和管道系统)

真空脱气时防止泵油带入流动相。用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和玻璃器皿配制流动相。已经污染的流动相一定要废弃掉。

2仪器组成及电源

本系统可进行多达四元溶剂的梯度洗脱操作

2.1 仪器组成 本系统由Waters 600E 多溶剂输送系统,四通道在线过滤,7725i进样器,996型二极管阵列检测器,联想品牌机等单元组合而成。

2.2 电源 仪器使用时按泵、检测器、打印机和计算机的顺序,依次接通电源。

3  600E高压输液泵的操作

3.1 液相色谱系统泵的流速在0.1-10.0ml/min之间,要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,流动相的过滤和流动相的脱气。下面列出预防泵故障的注意事项:(1)用高质
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量的试剂和HPLC级溶剂;(2)过滤流动相和溶剂;(3)脱气;(4)工作时使用泵头的排水孔不停的用10%甲醇/水的混合溶剂冲洗柱塞杆;(5)不让水和腐蚀性溶剂滞留在泵中;(6)定期更换垫圈;(7)加润滑油。处于良好操作状态的泵,应该使色谱图上的基线平稳,保留时间的重复性良好。等度洗脱时压力波动小于±2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。
3.2  常规准备工作 包括:开通电源,溶剂脱气,泵头及溶剂管路除气泡及泵的启动。
3.2.1 接通系统电源,控制器开通后进行自检,数秒后通过,接受操作指令。
3.2.2 溶剂瓶脱气 打开四通道在线过滤器,脱气15min。
3.2.3 系统中气泡的排除 泵启动时,调节所需要的通道流速为1ml/min,该通道如A调节为100%。将抽液阀旋至draw位,用针筒抽A液10ml,将抽液阀旋至inject位,并推出针筒中的液体,将抽液阀旋至run位。此时参比阀排出的液体应连续,如不连续则重复以上抽液排液操作。重复以上操作分别抽取B,C,D液10ml。将流速减小至0.2ml/min,将参比阀关闭。柱前气泡如不能排除,则管路在不与色谱柱连接的情况下,提高流速至9ml/min,数分钟后将流速减至1ml/min。
3.3 等度(Isocratic)操作 按direct键,进入isocratic菜单。依次设定流路配比,氦气流速,柱温。设定方法如下:按光标移动键,至闪烁光标出现在所需设定位置上。用数字键设定数值,按enter键确认,注意每个流动相其组成之和应为100%,设定流速为0.1ml/min,逐渐增加流速至实验所需的流量,待系统平衡后开始实验。
3.4 梯度(Gradient)洗脱操作 梯度洗脱需要编制梯度表和程序事件(Program event)表,在OPERATE GRADIENT屏幕时运行。按program method键,进入梯度编辑窗口。移动光标键至table #处,输入数字键(1-15),按enter键,将光标移至梯度表第一行,依次输入流速和流量配比,分别按enter键确认。光标移至第二行,依次输入梯度时间,流速,配比及曲线号(1-11),重复以上操作,至梯度表全部编完,按显示屏对应功能键save,并记住table #。按Program event键,进入程序事件表的编制,移动光标键至table #处,输入数字键(1-15),按enter键,将光标移至事件表第一行,依次输入事件号(1-10)和开关,按enter键确认,光标移至第二行,依次输入事件时间,事件号,和开关,按enter键确认,重复以上过程至事件表完成,按save键储存。
3.5 梯度程序的运行 按operate methods键,进入梯度方法运行窗口,将光标移至table处,输入欲运行的表号(1-15),按显示屏对应功能键start run,运行。在设置时,如有疑问,可用HELP提示每个设置的含义。
3.6 实验结束 对泵进行冲洗后,关闭流量,注意流速必须要逐步变化。冲洗顺序:如果使用有缓冲液的流动相,则停泵前一定要用HPLC级纯水清洗HPLC系统。同时用清水清洗柱塞杆。若停泵存放时间超过一天,则停泵前还需用水/甲醇清洗系统。
3.7 关闭电源开关。
4 进样
4.1 采用7725i手动进样器,进样环(loop)体积为20μl,上样量在10~20μl时,进样体积必须大于loop体积的3-5倍,才能得到好的重现性,上样量小于10μl时,可以用10μl的微量进样器直接进样。进样后,快速旋转进样器的把柄,直接把样品进到色谱柱的柱头。
4.2 在做标准曲线时,进样浓度应由低到高。
5 信号检测及数据处理
5.1 本系统用996型二极管阵列检测器,波长范围在190-800nm,接受全波长光谱。在分析过程中测定吸收信号由计算机进行处理,显示色谱图或光谱图,列出数据处理结果。测量结束时按规定退出程序后关机。
5.2 点灯,指示灯亮。诊断,检查校准。状态灯点亮,处于准备状态。稳定1小时后可以用于采集数据。
5.3 常规准备工作  按色谱仪、检测器、打印机及计算机顺序接通电源。
5.4 进入Millennium32菜单,按Login,输入User Name and Pass Word后,按OK。
5.5 按Configure System进入子菜单,在建New chromatography System, 先删旧的,单击Project ,建New chromatography System,选择所需要的W600,及检测器(PDA or ELSD),输入System Name,按Finish。
5.5 使用Run Sample窗口可采集处理和报告数据
5.5.1 从Millennium32 登录窗口,双击Run Sample。
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5.5.2 从Run Sample 对话框,选择色谱系统并单击确定,将建立BusLAC/E连接。
5.5.3 从菜单条中选择Edit>New Method Set单击Yes。
5.5.4 单击New Create以创建新仪器方法。屏幕上显示Edit Instrument Method。单击各仪器。
以编辑仪器参数,然后选择File>Save As以命名、标记(约束应用环境)并保存方法。然后选择File>Exit。
5.5.5 出现Select Instrument Method对话框。选择刚刚创建的方法,然后单击Next。向导将提示用户输入适用于方法的信息。
5.5.6 Method Set Editor对话框将出现。核实信息,然后选择File> Exit。
5.5.7 在Run Sample对话框中,单击Sample选项卡,在样品表中输入样品信息。使用水平滚动条访问每行中的所有信息。
5.5.8 单击工具条上的 (Amounts),为各标准样品瓶输入组份名称和浓度。选择File> Exit,返回Run Sample。
5.5.9 核实运行模式是否设置成Run And Process或Run And Report。如有必要,使用下拉列表更改该条目。
5.5.10 选择File> Save Sample Set Method以保存方法。
5.5.11 使用Intrument Method下拉列表选择仪器方法。单击设置。
5.5.12 要收集数据,请单击工具条上的 (绿灯)。
5.6 使用处理向导创建处理方法
5.6.1 从Millennium32 登录窗口,双击Browse Project。选择要使用的Project
5.6.2 单击通道选项卡,然后单击工具条上的 (Review)。出现查看屏幕。
5.6.3 单击工具条上的 (Process Method Wizard),然后单击确定。从下拉列表中选择适当的处理类型,然后单击确定。向导将引导您逐步完成积分和校正参数的设置。
5.6.4     要在处理方法中输入某组份的多个浓度,或给它添加高级积分,请选择View> 处理方法布局
5.6.5 选择File>Save As> Method Set,将该处理方法保存为方法组的一部分。
5.7 查看结果
5.7.1 在Project窗口中,单击Result选项卡
5.7.2 加亮显示感兴趣的样品(未知样或标准样),然后单击Review图标。查看窗口显示色谱、保留时间和组份名称。
5.7.3 单击窗口底部状态条中的Peak选项卡,显示峰信息。对于PDA 数据,如果在处理方法中选择了Peak Purity和Library,则会显示此两者的信息。
5.7.4 要查看校正曲线,请选择Window> Calibration。
5.7.5 要查看结果的所有详细信息,请选择Window> Result。
5.7.6 要打印结果,请从Project窗口单击Result选项卡,然后选择要打印的结果。单击 (打印),选择所需报告,然后单击确定。
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