主题：【分享】非变性条件下GFP的制备聚丙烯酰胺凝胶电泳

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发表于：2011/01/15 17:11:17 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

本实验讲义是在接受了去年实验的成功经验和失败的教训的基础上编写的。实验的名字叫“分子生物学技术综合实验”，原来是想把它设计成一个彼此连贯、前后呼应的系列实验。但由于经费和条件的限制，还是放弃了这个念头。

实验分成两个部分：前一部分是DNA的操作，主要是DNA片段的亚克隆的方法；后一部分是蛋白的操作，主要是凝胶电泳和免疫杂交。两个部分的分量大致相当，但后一部分做起来对学生的收获可能更大些，因为很少有本科生能一个人原原本本地亲手做一做免疫印迹实验的。它的操作虽然并不复杂，但成本却很高，特别如果使用的是从公司购买的抗体的话。

实验讲义在文字上，主要参考了魏群主编的《分子生物学实验指导》，而在实质内容上，DNA操作部分更多的是参考了萨姆布鲁克等人的《基因克隆》第二版的中译本，蛋白质部分主要是根据自己平日工作的积累。

希望同学们能够珍惜这次机会，认真地做实验，真正地掌握些实实在在的实验操作技能，为今后的学习和工作打下基础。千万不要忽视实验技能的培养和提高，生物学的成就毕竟主要是通过实验干出来的。

非变性条件下GFP的制备聚丙烯酰胺凝胶电泳

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2011/1/15 17:12:01 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

[实验原理]

制备电泳与普通的分析电泳在原理上没有什么不同，只是用的凝胶厚些、加的样品量大些罢了。因为制备电泳的胶厚，电泳时有个散热问题，电泳后还有把所要分离的蛋白从胶中洗脱下来的问题。为了提高制备电泳的效率，有些公司（如BIO-RAD）生产了专为制备电泳设计的电泳槽。我们的实验用非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳制备GFP，在整个的电泳过程中GFP始终维持其天然活性。电泳结束后，不用染色处理，在紫光照射下可以很容易地将发绿色荧光的GFP条带从凝胶上切下来。

[实验操作]

1、用1.5毫米夹条的玻璃板做胶，分离胶的浓度仍为12%，注意用不含SDS的非变性系统缓冲液配胶，配浓缩胶时也同样。

2、做浓缩胶时不加梳子，而是做分离胶那样用水封顶，使浓缩胶的顶部形成一平面。

3、制备电泳的蛋白样品与前次免疫印迹的相同，用非变性的样品缓冲液做样，样品不加热处理。上样前要充分离心(1.5mL离心管，12000rpm，5分钟），勿使所加样品中含有沉淀。

4、上样量0.2-0.4mL，上样后要使样品的高度在整个浓缩胶面上均匀分布。

5、在样品完全走进浓缩胶前电流不要调得过大，以免样品发热，产生明显的对流。待样品完全走进浓缩胶后可以加高电压，但不要超过150V，以防过热。

6、电泳结束后，取下并打开玻璃板“三明治”，在紫光灯下用刀片将发绿色荧光的条带从胶上切下，切成小段，放于干净的1.5mL离心管中，冷冻保存。

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