(二)基因型、基因突变和多态性分析
在同一物种不同种群和个体之间,有着多种不同的基因型,而这种不同,往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比较,就可以得出基因与性状的关系。但是,由于大多数性状和遗传性疾病是由多个基因同时决定的,因此分析起来就十分困难,然而基因芯片技术恰恰解决了这一问题,利用其可以同时反应数千甚至更多个基因的特性,我们就可以分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系。美国Stanford大学的E.A.Winzeler等,以两种不同菌株的酵母(S96和YJM789)作为实验材料,对控制酵母对放线菌酮的抗药性的基因进行分析。将含有酵母150000个DNA片断的基因芯片分别与这两株酵母活化转录的mRNA分子杂交,S96几乎全部吻合,而YJM789与芯片上的探针组存在较大的差异,约有3000个位点没有杂交显色。由于S96对放线菌酮有抗药性而YJM789的抗药性则弱的多,因此可以判定控制这一抗药性的基因的所在。而后,通过对S96和YJM789杂交后产生的抗药子代的遗传标记的分析,进一步确定,控制该抗药性的基因位于15号染色体,是一长约57000个碱基的片断。美国国家人类基因组研究室的J.G.Hacia等在Fodor研究小组的协助下,将基因芯片应用于双色突变分析。他们的分析对象是与人类遗传性乳腺癌和卵巢癌密切相关的BRCA1基因的外显子11。在扩增后,将BRCA1基因的外显子11置于含有荧光素-12-UTP的环境中进行体外转录反应,而后将转录产生的mRNA与BRCA1外显子11芯片杂交,4小时后,用藻红蛋白染色。在观察时,用488nm的氩离子激光进行扫描,荧光染色位点呈现绿色,而藻红蛋白染色的位点呈现红色。应用双色分析,可以更为清楚的监测未知样品与标准链之间的竞争性杂交情况,进而分析该基因中的不同突变。通过对15名患者BRCA1基因的观察,有14名患者在外显子11位点存在不同的突变。Hacia等在1.28 cm×1.28 cm的芯片上固定了9.66×104个长度为20nt的寡核苷酸探针,用于检测乳腺癌基因BRCA1的exon11 (3.45 kb)中所有可能的碱基置换、插入和缺失(1~5 bp)突变。针对每一个位点,共有28个独立的探针,14个针对有义链,14个针对反义链。14个探针包括2个野生型,3个碱基置换、4个插入突变、5个碱基缺失。在15例患者样品中,发现有14例有基因突变,类型包括点突变、插入及缺失等;在20例对照样品中均未检出假阳性结果,结果表明DNA芯片技术可快速、准确地研究大量患者样品中特定基因所有可能的杂合变。Cronin等分别用两种DNA芯片检测囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)的突变,其中一个芯片包含1480个探针,检测了CFTR基因的第10和11外显子的已知突变,包括缺失、插入和单碱基置换,并分析了10个未知样品的CFTR基因,其结果与PCR-RELP的分析结果完全一致。
Guo等人利用结合在玻璃支持物上的等位基因特异性寡核苷酸(ASOs)微阵列建立了简单快速的基因多态性分析方法。将ASOs共价固定于玻璃载片上,采用PCR扩增基因组DNA,其一条引物用荧光素标记,另一条引物用生物素标记,分离两条互补的DNA链,将荧光素标记DNA链与微阵列杂交,通过荧光扫描检测杂交模式,即可测定PCR产物存在的多种多态性,该方法对人的酪氨酸酶基因等4个外显子内含有的5个单碱基突变进行分析,结果显示单碱基错配与完全匹配的杂交模式非常易于区别。这种方法可快速、定量地获得基因信息。β-地中海贫血中变异的检测也论证了该方法的有效性和可信性。Lipshutz等人采用含18,495个寡核苷酸探针的微阵列,对HIV-1基因组反转录酶基因(rt)及蛋白酶基因(pro)的高度多态性进行了筛选。微阵列中内部探针与靶序列的错配具有明显的不稳定性,据此可快速区别核酸靶的差异。例如检测序列5'GTATCAGCATXGCCATCGTGC中X碱基的种类,可用下列4种探针3'AGTCGTAACGGTAGC,3'AGTCGTACCGGTAGC,3'AGTCGTAGCGGTAGC,3'AGTCGTATCGGTAGC。高密度探针阵列可检则具有特征性的较长序列相关的多态性与变异。筛选1,000个核苷酸序列的变异与多态性需要4,000个探针。用100μm合成位点,设计1.28cm2阵列,将有大约16,000个探针,能筛选4kb序列。HIV-1基因组中rt与pro在疾病过程中易于发生多种变异,这些变异将导致病毒对多种抗病毒药物包括AZT、ddI、ddC等出现明显抗性,因此检测和分析rt与pro的变异与多态性具有重要的临床意义。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加,变异与多态性分析将越来越重要。Chee等用含有1.35×105个长度为25nt的寡核苷酸探针,分析了16.6 kb的人类线粒体基因组DNA(mt DNA),共分析了10个样本,检测出了505个多态性位点,并在Leber′s遗传性视神经疾病患者的mt DNA中检测出3个致病性突变位点。
随着人类基因组计划的逐步发展,研究人员分析出了越来越多的基因序列。下一步,就是要分析这些基因的多态性与生物功能和疾病的关系,而这需要对大量个体进行分析。通过基因芯片SNP(单核苷酸多态性)定位试验,可以确定基因多态性和疾病的关系,同时也可确定致病的机制和病人对治疗的反应等。同样,对于许多与人类疾病密切相关的致病微生物,也可对其进行基因型和多态性分析,1998年,法国T.Livache等就成功的利用基因芯片技术,对人血中的HCV病毒进行了基因型分析。SNP基因芯片的成功将使临床诊断上到一个新的台阶。
(三)疾病的诊断与治疗
人类的疾病与遗传基因密切相关,基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析,因此它在疾病的分子诊断中的优势是不言而喻的,就临床一种新的、强有力的分子工具。基因芯片技术已经被应用于感染性疾病、肿瘤和药物代谢等方面的研究。
1.遗传病相关基因的定位 90年代以来,随着人类基因组计划的发展,各种方法被相继创立并应用到基因定位中。我国有4000万育龄妇女,每年有2000万新生儿,准确检测遗传病基因是优生优育的技术保障。DNA芯片充分结合并灵活运用了大规模集成电路制造技术、自动化技术、计算机及网络技术、激光共聚焦扫描、DNA合成、荧光标记探针、分子杂交及分子生物学的其它技术,在这一领域的研究中有着巨大的潜力。这一技术已成为基因定位研究的高效工具。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加,变异与多态性分析将越来越重要。HGP使许多遗传疾病基因得以定位,配合使用多位PCR (multiplex-PCR)/DNA芯片可一次筛查多种遗传病,既经济快速又敏感可靠。
2.肿瘤诊断 已用基因芯片检测人鼻咽癌、肺癌基因表达谱、肿瘤原癌基因和抑癌基因的发现和定位。早在1996年,M.J.Kozal等就利用基因芯片,对HIV-I B亚型中的蛋白酶基因的多态性进行了分析,这也是基因芯片技术被首次应用于临床实践。在艾滋病的治疗中,使用HIV蛋白酶抑制剂是一种重要的手段。然而,病毒对该药物的反应却有着很大的差异。利用基因芯片技术,研究人员分析了取自102个病人的167个病毒单体,发现这些同为美国HIV-I B亚种的病毒的基因序列存在极大差异,其中蛋白酶的基因片断差异最大,在编码99个氨基酸的序列中,竟有47.5%存在明显突变。这些氨基酸的突变,直接导致了病毒抗药性的不同。含96600个20体寡核苷酸高密度阵列对遗传性乳腺和卵巢癌BRCA1基因3.45 kb的第11个外显子进行杂合变异筛选,15个患者的已知变异的样品中,准确诊断出14个患者,20个对照样品中未发现假阳性。用Affimetrix p53芯片和PCR-SSCP调查42例有乳癌史的家系,p53基因13964位的G变为C,突变率为7.1%;无乳癌家族史者为0。Favis等用多位PCR/连接酶检测反应(PCR/LDR)在一个试管内同时检测数百个基因突变,用于检测大肠癌组织k-ras和p53突变及BRCA-1和BRCA-2低频率突变收到良好效果。
人类恶性肿瘤中,约有60%与人类p53抑癌基因的突变有关,目前研究人员已经研制成功了可以检测p53基因所有编码区(外显子2~外显子11)错意突变和单碱基缺失突变的基因芯片。以外显子7的第248个密码子为例,野生型为CGG,在芯片上做出5条探针,相应位点分别为GAC、GCC、GGC、GTC和G-C,根据杂交后的荧光显色图,就可以分析出该位点为何种突变。
3.感染性疾病的诊断 HIV-1基因组中rt与pro在疾病过程中易于发生多种变异,这些变异将导致病毒对多种抗病毒药物包括AZT、ddI、ddC等出现明显抗性,因此检测和分析rt与pro的变异与多态性具有重要的临床意义。Hayward以3648个插入片段建立猎枪微阵列(shotgun microarray),通过差异杂交和DNA测序找到了疟原虫无性和有性生殖阶段基因差异表达,为抗疟药设计提供了线索。可以预测在不久的将来,人们可望在一张DNA芯片上检测几乎所有的病原微生物基因,实现真正意义上的“组合检测(profile tests)”。
4.耐药菌株和药敏检测 据WHO报告,全球每年约有800万结核病患者,有300万人死亡,死亡人数超过了艾滋病和疟疾的总和。主要原因是菌株对不同的药物产生了抗药性(俄国80%TB对一种药物产生抗性;美国50%为多重耐药)。对每例患者进行菌株和药敏鉴定是控制TB的关键。最近,俄美两国科学家开发了具此功能的基因芯片,可使医生及早使用敏感药物。该芯片(TB Biochips)将抗性菌株的单链DNA标记后固定在玻片上,与待检TB株杂交,临床使用未见假阳性,该芯片可清洗后重复使用50次。
(四)药物研究中的应用
从经济效益来说,最大的应用领域可能是制药厂用来开发新药。所以已经有多家制药企业介入芯片的开发。如: Incyte Pharmaaceuticals Inc.,Sequana Therapeutics,Millenium Pharmaceuticals Inc.等。对于寻找新药来说,目标之一是应用芯片可以在基因水平上寻找药物靶标。采用所谓“译码器”策略(Decoder strategy)来确定药物靶标。从而找到“导向药物”。基因芯片也被用于寻找蛋白激酶抑制物。细菌或肿瘤组织的耐药性也涉及基因改变可以用DNA芯片鉴定。
1.新药开发 高通量的DNA芯片可发现众多的新基因和新的靶分子用于新药的设计。噬菌体展示技术可创造大量蛋白质,目前多用于抗体库的建立和筛选,进而可用于受体-配体相互作用的研究。基因组学、蛋白质组学和生物信息学(bioinformatics)将大大促进制药工业的发展。目前第一个生物分子工程药物Herceptin已用于乳癌的治疗,并获得美国FDA的批准。除肿瘤外,用分子生物工程设计的药物可用于治疗遗传病及代谢疾病、抗衰老、设计新的抗生素和工业用酶等。
同时,有时一种药物的作用是多方面的,基因芯片有助于发现一种药物的新的功能。原先设想的作用是针对某一靶标的,但在全基因或广范围筛选中却发现该药在另一方面有很强的抑制作用,从而开发成另一种新药。
2.调查药物处理细胞后基因的表达情况
基因芯片在用来研究药物的作用机理时十分有用。Marton等人利用基因芯片构建了免疫抑制性药物FK506处理酵母细胞后的基因表达图谱。发现用FK506处理的酵母细胞基因表达图谱与FK506靶标的无意义突变体相似。而用FK506去处理此突变体,发现了不同于野生型的作用机制。Clarke等用基因芯片研究了肠癌患者化疗前和治疗期间肿瘤基因表达情况,发现丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶治疗均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表达增加。该研究提示,这类研究既有助于阐明药物的作用机制,也有助于确定药物作用的靶基因,为新药研究提供线索。
3.对药物进行毒性评价
应用芯片查找药物的毒性或副作用,进行毒理学研究。尤其是慢性毒性和副作用,往往涉及基因或基因表达的改变。如果药物能抑制重要基因的表达,则对它的深入研究就值得考虑。用芯片作大规模的表达研究往往可省略大量的动物试验。若某个正在筛选的潜在药物作用靶细胞得到的基因表达图谱与已知的具有毒性副作用的药物得到的基因表达图谱相似时,就要考虑是否停止药物开发(drug development)中花费巨大的临床实验阶段。Nuwaysir等研制了包括涉及细胞凋亡、DNA复制和修复、氧化应激/氧化还原内稳态、过氧化物酶体增殖反应、二恶英/多环芳烃反应、雌激素反应、看家基因、癌基因和抑癌基因、细胞周期控制、转录因子、激酶、磷酸酶、热休克蛋白、受体、细胞色素P450等共2090个基因的毒理芯片(ToxChip v1.0),该芯片既可用于毒物的检测和遗传多态性的检测,又可用于受检毒物的毒作用机制的研究。最近,Holden等从人和小鼠文库中选择约600个与毒理学相关基因的cDNA克隆,制备了种属特异的毒理基因组学芯片,可研究肝脏毒性、内分泌干扰、致癌作用等毒性终点的作用机制,也可用于确定以基因表达模式为基础的化合物的毒性。