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主题：【求助】用荧光染料衍生核酸，染料会吸附到裸管内壁吗？

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katherine7
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发表于：2011/01/18 21:07:50 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
对核酸Marker进行柱前衍生，然后进行分离。但是始终没有峰出现，且RFU一直在0-0.5之间抛物线变化。不知道这到底是怎么回事，是不是样品根本没运行到检测窗口，或者标记染料被脱去了？对废液进行琼脂糖凝胶电泳检测，并未发现含我的样品。
如果说荧光染液是吸附到内壁上了，且一直未洗脱掉，那到底要怎样才能彻底清洗干净毛细管柱？
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2011/1/18 21:38:38 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
进样后用压力推一下试试，看看能出峰么？
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katherine7
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2011/1/18 21:50:51 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 sunpengwjh(sunpengwjh) 发表:
进样后用压力推一下试试，看看能出峰么？

用压力推一下？怎么个推法呀？
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2011/1/18 22:16:46 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 katherine7(katherine7) 发表:
原文由 sunpengwjh(sunpengwjh) 发表:
进样后用压力推一下试试，看看能出峰么？

用压力推一下？怎么个推法呀？

电泳不是可以冲洗柱子么？进样后直接用冲柱子的方法，看看能不能将样品推出来，正常应该可以的！
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poplar_yang
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2011/1/20 2:58:30 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
you can do it separately:
对核酸Marker进行衍生以后, 直接进行琼脂糖凝胶电泳检测，是否发现样品?
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katherine7
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2011/1/20 15:32:41 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 poplar_yang(poplar_yang) 发表:
you can do it separately:
对核酸Marker进行衍生以后, 直接进行琼脂糖凝胶电泳检测，是否发现样品?

直接琼脂糖凝胶电泳检测，发现样品，且亮度明显。
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poplar_yang
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2011/1/22 3:43:18 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
"对废液进行琼脂糖凝胶电泳检测，并未发现含我的样品。"

对废液进行琼脂糖凝胶电泳检测，do you 发现衍生用的荧光染dye?
if yes, your sample is degrade
if not, your 是样品根本没运行到检测窗口.

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poplar_yang
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2011/1/22 3:44:29 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
柱前衍生的核酸稳定多长时间, 我们发现最长约两天后，然后降低
稳定多长时间依靠pH, buffer, ionic force, temperature.

if the CE column condition is different, pH can make this degrade going fast in 40min.



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heguang
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2011/1/28 11:27:41 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
核酸与SYBR类染料的结合是动态的，如果你不在毛细管里加入一定的染料，那么核酸在跑毛细管电泳的时候可能会和染料解离，导致你检测不到核酸。
你可以将低浓度的SYBR染料加入buffer中，防止核酸与其解离。低浓度的染料不会产生荧光背景。
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katherine7
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2011/1/31 16:58:14 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 poplar_yang(poplar_yang) 发表:
"对废液进行琼脂糖凝胶电泳检测，并未发现含我的样品。"

对废液进行琼脂糖凝胶电泳检测，do you 发现衍生用的荧光染dye?
if yes, your sample is degrade
if not, your 是样品根本没运行到检测窗口.


The answer is not. 后来延长了分离时间，也没有改善分离结果。还是没有样品峰
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katherine7
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2011/1/31 17:11:24 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
延长了分离时间，仍然没有东西。极可能是在跑毛细管电泳时核酸与染料解离了，且染料被毛细管柱吸附了，毕竟高浓度的染料应该也有荧光吸收才对。
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