实战宝典 原创大赛 仪器问答 仪友会 总帖：8042807今日发帖：8 我的社区 签到
快速导航 采购仪器 提醒
化学药检测
版主:
入住本版
专家:
居民列表

主题：【转帖】【转】体内药物分析的血样预处理问题面面观

浏览0 回复13 电梯直达
省部重点实验室
头像
结帖率：
100%
关注：0 |粉丝：0
新手级： 新兵
发表于：2012/06/23 23:50:42 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
主题：体内药物分析的血样预处理问题面面观
格式：可分为处理方式、萃取方法、测试结果、存在问题、经验教训五项。
具体内容为：
处理方式：液液萃取LLE，固相萃取SPE，
萃取方法：萃取溶剂的选择与使用，洗脱溶剂的选择与使用，及操作步骤；
测试结果：空白基线，萃取效果，操作的利弊与现象；
存在问题：血样空白基线的好坏，萃取回收率的高低，杂质峰与药物峰的重现性：峰时与峰高，
经验教训：除自己的体会外，也可发出疑问，请大家点评。

主题：液液萃取LLE中的乳化问题
处理方式：液液萃取LLE，
萃取方法：1ml血浆,用二氯甲烷6ml提取；几天后改用了0.5ml血浆,3ml二氯甲烷；二氯甲烷加异丙醇
测试结果：易乳化，提取率降低，乳化又不见了。
存在问题：开始几天是1ml血浆,用二氯甲烷6ml提取,很容易乳化,加固体氯化钠或者冰冻都不解决问题,无法分层进样.后来用二氯甲烷加异丙醇不再乳化,但是提取率降低,尤其在低浓度勉强可达50%时，几天后改用了0.5ml血浆,3ml二氯甲烷；结果竟然不乳化了
经验教训：用的空白血浆是一袋一袋做的,这一袋用完了用下一袋,虽然是另外一个人的,但肯定是健康人.与有机相和水相的比有关吗?我还能用二氯甲烷来提取并建立方法吗?
该帖子作者被版主 生活就这么美好加 2积分， 2经验，加分理由：发帖奖励
为您推荐
近期热榜
热门活动
您可能想找: 气相色谱仪(GC) 询底价
选参数 看心得 找厂商 查方案
专属顾问快速对接
立即提交
可能感兴趣
省部重点实验室
gl19860312
结帖率：
100%
关注：0 |粉丝：0
新手级： 新兵
2012/6/23 23:51:13 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
主题：微孔滤膜沉淀蛋白，过滤后溶液浑浊的问题
处理方式：甲醇沉淀蛋白0.45的微孔滤膜过滤
存在问题：经常出现溶液过完微孔滤膜后放置时间稍长（>30min)后就浑浊，导致不能把所有的样品都做好前处理，然后使用自动进样器进样，只能临进样前先过滤，再进样。
经验教训：排除滤膜本身的问题，我想可能是样品沉淀蛋白高速离心后，溶液温度较高，药物在溶液中溶解度较大，过滤后，随着放置的时间的延长，温度降低，药物溶解度变小，药物析出。解决方法，离心后先不过滤，冰箱内放置5min，再过滤，问题解决。但不知原因分析的正确与否，请战友批评指正。
赞贴
0
收藏
0
拍砖
0
举报
省部重点实验室
gl19860312
结帖率：
100%
关注：0 |粉丝：0
新手级： 新兵
2012/6/23 23:52:07 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
主题：雷公藤药代问题
方法：萃取后衍生再进气相
问题：1、萃取液：想问问根据各位老师做的经验，萃取液用那种比较好，比如乙酸乙脂与氯仿乙醚混合液（比例1：3）
衍生：在衍生过程中，温度控制是不是比较重要，
衍生剂与反应剂用量有没有很明确用量比（我做的时候大多的时候是过量）
溶解：当我们处理完样品后，溶解这部做各位是怎么去完成的，看了很多文献大部分是用0.1或者1ml去溶解，当用0.1ml去溶解的时候，相对来说很难将所有的样品溶解，误差也比较大，

还有一个问题：各位老师在给大鼠取血用那种方式比较好（眼球取血？骨动脉取血？）我现在在做预试验，每次都是取全血，
赞贴
0
收藏
0
拍砖
0
举报
省部重点实验室
gl19860312
结帖率：
100%
关注：0 |粉丝：0
新手级： 新兵
2012/6/23 23:53:00 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我做过几个生物利用度，接触过血浆的处理，下面提供一个生物利用度的资料，希望对大家有用，恳请斑竹能够加分!
第四部分                        临床研究资料

药品名称：A分散片
资料项目名称 临床研究报告 资料项目编号（32）

试验单位（盖章）：
试验负责人：   
试验参加者：
  临床部分：
  样品分析部分：
试验起止日期：2003年8月～2003年11月
原始记录保存处：
联系人：
联系电话

新药申报单位：
2003年12月

摘  要
1、本实验建立的血浆中A的HPLC测定法，血浆中杂质不干扰样品的测定，标准曲线线性范围为20ng/ml～2500ng/ml，线性关系良好；高、中、低四种浓度的日间和日内变异均小于10.0%；绝对回收率在86.66～96.35%；符合生物样品分析要求。
2、20名健康受试者随机交叉口服B的A分散片2片（内含A50 mg）和50 mgC的A片后，用HPLC法测定血浆中A浓度。以C的A片为标准对照，用面积法估算(AUC0-τ)的B的A片相对生物利用度以A计为95.9% ±17.5%。20名健康受试者口服B的A片2片（共含A50 mg）后，估算的A的消除半衰期为2.13 ±0.49小时，达峰时间和达峰浓度分别为0.5 ± 0.1小时和1321.15 ±277.51 ng/ml。口服50mgC的A片后，估算的A的消除半衰期为2.11 ±0.47小时，达峰时间和达峰浓度分别为0.8 ± 0.2小时和1397.26±324.16 ng/ml，两种制剂的A的药代动力学参数相近。
对两制剂的A的参数Cmax、AUC0-τ先进行方差分析，再进行双单侧t检验。双单侧t检验结果表明上述两个参数生物等效，Tmax经非参数法检验有显著性差异(P>0.05)，这表明B研制的A分散片与C生产的A片以A计生物等效。

本实验通过测定血浆中A的浓度观察健康志愿者口服B研制的A分散片(受试制剂)后的血药浓度经时过程，估算相应的药代动力学参数，并以C的A片为参比制剂，进行生物利用度和生物等效性评价，为临床用药提供参考依据。

1、实验材料
1.1、试验药品
1.1.1、受试制剂
制剂：A分散片
生产厂家：
  批号：20021228
规格：25mg/片
1.1.2、参比制剂
参比制剂：A片
生产厂家：C
规格：25mg/片
批 号：0209201
1.2、试剂
试验用水为去离子水，乙腈（色谱纯，Merck Company），其它试剂为AR试剂。
1.3、仪器
hp1090 高压恒流泵 。
色谱工作站：N2000数据工作站。
Shimadzu SPD-10A 紫外检测器。
2、血浆中A的HPLC测定
2.1、色谱条件
流动相：乙腈- 10 mmol/L的磷酸二氢钾水溶液pH调至6.5（45：55，v/v）；
流 速：1.0 ml/min；
色谱柱：汉邦 C18 5 mm 250 mm×4.6 mm i.d. (淮阴汉邦科技股份有限公司)；
柱 温：室温
2.2、A标准溶液的配制
标准溶液的配制：精密称取A10 mg，置于10ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1 mg/ml A的储备液。取储备液1.0ml置于10 ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，即得100 μg/mlA甲醇溶液；依次稀释，配成10 μg/ml，1 μg/ml，的A甲醇标准溶液。
内标溶液(地西泮)的配制：精密称取地西泮10 mg，置于10ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1 mg/ml内标储备液；依次稀释，配成20μg/ml内标甲醇溶液。
2.3、血浆样品的处理
于离心管中精密加入血浆样品1 ml，内标溶液(20μg/ml ) 100 ml，涡旋混匀，加入0.1 mol/LNaOH溶液0.1 ml，涡旋混匀，加入乙酸乙酯5 ml，涡旋3 min，于4000 r/min离心10 min。分取有机相约4 ml于另一离心管中，于45℃水浴中以氮气流吹干。残渣用100 ml流动相溶解，16000 r/min离心5 min，吸取上清液20μl，进样分析。
2.4、样品的色谱行为(特异性)
在本实验所采用的色谱条件下，A出峰时间在4.8 min左右，内标出峰时间在9.5min左右。 A和内标峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳(图1)。本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的A的浓度，灵敏度较高。

(A) (15,

(C) (D)

(E)
图1、血浆中AHPLC图
(A) A的色谱图
(15, 内标的色谱图
(C). 空白血浆色谱图
(D). 空白血浆加入A对照品和内标对照品后的色谱图
(E) 健康受试者口服A后的血浆样品色谱图
2.5、血浆中A标准曲线制备
取离心管数支，分别精密加入不同量的A标准液，吹干后加入空白血浆1 ml，涡旋混匀，配成20，50，100，200，500，1000，2000，2500ng/ml的标准含药血浆，平行制备5份，按“血浆样品的处理”项下操作，记录色谱图，计算A峰面积As和内标峰面积Ai的比值ƒ。以平均比值ƒ (ƒ=As/Ai)对血药浓度(C)作回归计算，得回归方程(见
表 1、图2)：
C =648.43׃ +10.207  (权重系数w=1/y)    r=0.99934
表 1、A在人血浆中的标准曲线(n=5)
  加入浓度 (ng/ml)  参数
  20  50  100  200  500  1000  2000  2500  a  b  r
f  0.0190127  0.065173788  0.1363047  0.2434119  0.7299998  1.5117492  3.126989  3.7358342  656.78  9.7287  0.99931
  0.0205055  0.066482215  0.1393123  0.2746893  0.7262124  1.6194607  3.2184921  3.8543332  634.15  9.0655  0.99938
  0.0195118  0.063293976  0.1378829  0.2718526  0.7196543  1.6252199  3.2485371  3.8280161  633.3  10.206  0.99913
  0.0186583  0.057065369  0.1247608  0.2533169  0.6916712  1.5383397  3.0407779  3.6021245  672.79  10.743  0.99918
  0.0182331  0.058010739  0.1199987  0.278331  0.7340304  1.6131642  3.1379612  3.743388  646.25  11.398  0.99927
mean  0.0191843  0.062005217  0.1316519  0.2643203  0.7203136  1.5815867  3.1545515  3.7527392  648.43  10.207  0.99934

(注：a: 标准曲线的截距斜率 b:标准曲线的截距 r:标准曲线的相关系数)

图2、A在人血浆中的标准曲线

2.6、精密度试验
取离心管数支，精密加入不同量的A标准液，吹干后加入1ml空白血浆，涡旋混匀，配成20，200，2000 ng/ml的标准含药血浆，按“血浆样品的处理”项下操作，在日内和日间(5天)对每种浓度各做5份样品，记录色谱图，计算A峰面积As和内标峰面积Ai的比值ƒ。求得日内和日间相对标准差，结果见表 2。

表 2、HPLC法测定血浆中A的日内和日间变异 (n=5)
浓度  日内变异  日间变异
(ng/ml)  20  200  2000  20  200  2000
ƒ  0.0191937  0.2602118  3.1901667  0.0188779  0.2623609  3.2012374
  0.0183941  0.2577500  3.1850039  0.0200935  0.2668696  3.2031630
  0.0173156  0.2605828  3.0968493  0.0192277  0.2531166  3.0625946
  0.0183834  0.2593889  3.2164097  0.0177509  0.2504043  3.1219391
  0.0202447  0.2724336  3.2292135  0.0174686  0.2539355  3.1910800
Mean  0.0187063  0.2620734  3.1835286  0.0186837  0.2573374  3.1560028
SD  0.0010885  0.0058931  0.0517875  0.0010802  0.0069562  0.0620203
RSD%  5.82  2.25  1.63  5.78  2.70  1.97

2.7、回收率试验(绝对回收率)
取离心管数支，精密加入不同量的A标准液，用甲醇配成浓度分别为20，200，2000 ng/ml的A溶液，每份1ml，加入100 ml内标溶液(20μg/ml)，以氮气流吹干后，用100 ml流动相溶解残渣，进样分析，记录色谱图，计算样品和内标的峰面积比值ƒs (ƒs=As/Ai)。
取离心管数支，分别精密加入不同量的A溶液，吹干后加入1ml空白血浆，涡旋混匀，配成含A20，200，2000 ng/ml的血浆，平行制备5份。分别加入加入100ml内标溶液(20 μg/ml)和0.1 mol/L NaOH溶液0.1 ml，涡旋混匀，加入乙酸乙酯5 ml，涡旋3min，于4000 r/min离心10 min。分取有机相于另一离心管中，于45℃水浴中以氮气流吹干。残渣用100ml流动相溶解，精密吸取上清液进样分析。记录色谱图，计算样品和内标的峰面积比值ƒx (ƒx=As/Ai)，将上述ƒx和ƒs的比值代入下式即可求得A的绝对回收率(R%)。结果见
表3。

表3、血浆中A的绝对回收率(Mean±SD，n=5)
加入浓度 (ng/ml)  20  200  2000
回收率（%）  90.23  94.44  96.58
  83.70  95.94  98.74
  85.80  95.03  96.03
  88.29  93.98  93.61
  85.29  96.22  96.78
Mean  86.66  95.12  96.35
SD  2.5851  0.9552  1.8422
RSD%  2.98  1.00  1.91
2.8、稳定性试验
取干净离心管数支，按标准曲线配制方法制备含A20，200，2000 ng/ml的标准含药血浆，平行制备4份，1份于配制好后按“血浆样品的处理”项立即提取分析，1份于室温放置8小时后同法操作；另外2份配制好后放入冰箱中冷冻分别保存5、10天后取出化冻，然后同法操作。
表 4、血浆中A的稳定性（Mean ± SD，n=3）
加入浓度(ng/ml)  20  200  2000
测得浓度平均值(ng/ml)  立即测定  23.22  197.73  2073.40
  室温8小时  22.58  198.27  2059.81
  冰冻5天  22.78  197.90  2038.27
  冰冻10天  22.41  194.88  2026.47
结果表明，A血浆样品在室温下放置8小时、冰冻5天及10天条件下稳定性良好。
2.9、方法小结
本实验建立的血浆中A的HPLC测定法，血浆中杂质不干扰样品的测定，标准曲线线性范围为20ng/ml～2500ng/ml，线性关系良好；高、中、低四种浓度的日间和日内变异均小于10.0%；绝对回收率在86.66～96.35%；符合生物样品分析要求。
3、A片在人体中药代动力学及其相对生物利用度研究
3.1、受试者选择
3.1.1、受试者选择依据及要求
1)  性别：男性；
2)  年龄：18~40岁，同批受试者年龄不宜相差10岁；
3)  体重：同一批受试者体重(kg)不宜悬殊过大；标准体重＝[身高(cm)-80]×0.7；
4)  不吸烟；不嗜酒；
5)  身体状况：无心、肝、肾、消化道、神经系统、精神异常及代谢异常等病史；体格检查示血压、心率、心电图、呼吸状况、肝、肾功能和血象无异常；
6)  两周前至整个实验期间不服用其它任何药物；
7)  3个月内未用过已知对某脏器有损害的药物；
8)  3个月内未参加献血者；
9)  签约知情同意书；
不符合上述要求之一者，不得作为受试者人选。
3.1.2、中止试验条件
1)、  受试者出现严重不良反应；
2)、  实验期间生病，需要接受治疗；
3)、  受试者要求中止试验；
4)、  其它原因如受试者不按实验要求等。
3.1.3、受试者来源
20名男性健康受试者，体重58～72 kg，年龄21～26岁，均为南京医科大学在校学生。经体检证明肝、肾功能正常(表 5)，心电图正常。实验前两周及实验期间未服用其它任何药物。实验期间统一饮食。
3.2、实验方案
采用双交叉实验设计，20名男性健康受试者随机分成A、B两组。即A组先口服受试制剂，再口服参比制剂，B组先口服参比制剂，再口服受试制剂。剂量均为25mg×2的A。两次服药间隔7天清洗期。
受试者于试验前1周和试验期内均勿饮用酒类和咖啡类饮料；试验前禁食过夜至少10小时(不禁水)。于次日早晨7：00空腹服用受试制剂或参比制剂，用200 ml 含葡萄糖的温开水送服；服药2小时后可再饮水，4小时后进统一餐；如受试者有低血糖症状，可以口服葡萄糖的温开水，不受时间限制。受试者服药后应避免剧烈运动，亦不得长时间卧床。
受试者于服药后0，0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，8，10，12，15，24h采血4 ml于肝素化试管中，分离出血浆，－4℃保存待测。
3.3、临床观察内容
试验工作在一期临床试验观察室进行。受试者应得到医护人员的监护。受试期间发生的任何不良反应，均应及时处理和记录。
赞贴
0
收藏
0
拍砖
0
举报
xiaowang268
xiaowang268
结帖率：
100%
关注：0 |粉丝：0
新手级： 新兵
2012/6/24 10:02:10 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我们的血样就是加三氯乙酸沉淀蛋白，离心，过膜，就OK 了
赞贴
0
收藏
0
拍砖
0
举报
省部重点实验室
gl19860312
结帖率：
100%
关注：0 |粉丝：0
新手级： 新兵
2012/6/24 23:32:27 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 xiaowang268(xiaowang268) 发表:
我们的血样就是加三氯乙酸沉淀蛋白，离心，过膜，就OK 了


纯度可以达到多少
赞贴
0
收藏
0
拍砖
0
举报
xiaowang268
xiaowang268
结帖率：
100%
关注：0 |粉丝：0
新手级： 新兵
2012/6/25 11:20:05 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 省部重点实验室(gl19860312) 发表:
原文由 xiaowang268(xiaowang268) 发表:
我们的血样就是加三氯乙酸沉淀蛋白，离心，过膜，就OK 了


纯度可以达到多少
赞贴
0
收藏
0
拍砖
0
举报
xiaowang268
xiaowang268
结帖率：
100%
关注：0 |粉丝：0
新手级： 新兵
2012/6/25 11:20:43 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 xiaowang268(xiaowang268) 发表:
原文由 省部重点实验室(gl19860312) 发表:
原文由 xiaowang268(xiaowang268) 发表:
我们的血样就是加三氯乙酸沉淀蛋白，离心，过膜，就OK 了


纯度可以达到多少

我们是血样分析啊，你的纯度是指？
赞贴
0
收藏
0
拍砖
0
举报
省部重点实验室
gl19860312
结帖率：
100%
关注：0 |粉丝：0
新手级： 新兵
2012/6/25 18:38:49 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 xiaowang268(xiaowang268) 发表:
原文由 xiaowang268(xiaowang268) 发表:
原文由 省部重点实验室(gl19860312) 发表:
原文由 xiaowang268(xiaowang268) 发表:
我们的血样就是加三氯乙酸沉淀蛋白，离心，过膜，就OK 了


纯度可以达到多少

我们是血样分析啊，你的纯度是指？


类似 回收率的问题啊
赞贴
0
收藏
0
拍砖
0
举报
xiaowang268
xiaowang268
结帖率：
100%
关注：0 |粉丝：0
新手级： 新兵
2012/6/26 19:09:35 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 省部重点实验室(gl19860312) 发表:
原文由 xiaowang268(xiaowang268) 发表:
原文由 xiaowang268(xiaowang268) 发表:
原文由 省部重点实验室(gl19860312) 发表:
原文由 xiaowang268(xiaowang268) 发表:
我们的血样就是加三氯乙酸沉淀蛋白，离心，过膜，就OK 了


纯度可以达到多少

我们是血样分析啊，你的纯度是指？


类似 回收率的问题啊

哦，还行吧
赞贴
0
收藏
0
拍砖
0
举报
青林
wyqql2060
结帖率：
100%
关注：0 |粉丝：0
新手级： 新兵
2012/6/29 23:38:46 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 xiaowang268(xiaowang268) 发表:
我们的血样就是加三氯乙酸沉淀蛋白，离心，过膜，就OK 了


要看情况而言！！很多蛋白沉淀剂
赞贴
0
收藏
0
拍砖
0
举报
手机版： 【转】体内药物分析的血样预处理问题面面观
猜你喜欢最新推荐热门推荐更多推荐
头像
高级回复 发表评论
品牌合作伙伴
岛津
日立科学仪器
珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）
日本电子株式会社
丹纳赫
安捷伦
赛默飞世尔科技
普析通用
欧波同
天美
天瑞仪器
德国耶拿
海能技术
马尔文帕纳科
磐诺科技
上海仪电科仪
梅特勒托利多
聚光科技
莱伯泰科
盛瀚
多宁生物
丹东百特
科哲
卓立汉光
屹尧科技
华谱科仪
宝德仪器
优莱博
HORIBA
布鲁克核磁