3.1 键合相基团脱落
绝大多数键合相都是通过硅氧硅键(Si-O-Si)连接在硅基质上,形成带有机基团的固定相Si-O-Si-R(R为G18H37、C8H17、CnH2n+1)。硅氧硅键可在水溶液中水解而断裂,使键合相基团脱落,对C2和NH2柱键合相基团脱落不可忽视。为减少或防止基团脱落,可增加流动相的有机溶剂量,降低离子强度和pH值,对基团已脱落的固定相,可用合适的硅烷试剂再生。
3.2 固定相分解或活性基团变性
例如氰基柱的保留时间显著缩短,但键合相中C、H、N的百分含量并无大变化,证明未发生—CN水解成-COOH反应,而是形成了衍生物。在硅上增加烷基可减少水解。
4、高效
液相色谱柱的保养
色谱柱在使用一段时间后,常遇到柱子受污染,柱效下降的问题,采用适当的方法对色谱加以保护和再生,能够延长色谱柱的使用寿命。
使用保护柱和过滤样品、流动相:流动相中若有不纯物聚积存柱顶,将影响柱寿命,所以溶剂应使用HPLC级的,样品和流动相用前先以微孔薄膜过滤。对于较昂贵的色谱柱,可以在柱前加一个保护柱,防止样品中杂质污染分析柱,对于制备柱,因其进样量大,使用保护柱尤为重要。
已污染柱的处理:因保留强的物质污染,柱顶或样品中不溶物沉积于柱顶,可用下列方法洗涤:(1)去除脂类可用四氢呋喃乙腈或甲醇洗涤;(2)去除蛋白质可用乙腈,丙醇和1%三氯乙酸进行梯度洗脱;(3)某些高疏水性化合物,可用乙腈或甲醇洗脱,同时反复注入四氢呋喃(100-200)ml。
对于使用一段时间后柱效下降的色谱柱可按下列方法进行再生。再生处理包括活化(右→左)和净化(左→右)两种。(1)硅胶、氧化铝和极性(正相)键合相色谱柱按下列顺序依次冲冼:三甲基戍烷或已烷→三氯乙烷→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水。(2)键合相硅胶柱:苯基、氰基键合相柱按以下顺序冲洗:蒸馏水→甲醇(冲洗过程中可加入少量二甲基甲酰胺)→分离样品用的流动相。(3)阴、阳离子交换柱:酸性有机物吸附在固定相表面的用低pH缓冲液冲洗,碱性有机物用高pH缓冲液冲洗,然后依次用蒸馏水→甲醇→二氯甲烷→甲醇→蒸馏水冲洗干净。
柱头处理:对于柱顶堵塞、严重污染,用溶剂冲洗无效的色谱柱,只有打开柱子去掉柱顶的填料重填:先拆下不锈钢烧结过滤器,检查柱床,常见塌陷或受污染的带色填料,剔掉无规则床层和带色填料,使柱床显白色并完全水平,再用甲醇作糊状填料匀浆液,将糊状填料匀浆液滴在柱上靠重力从匀浆液中排出甲醇液,重复直到填料水平。
柱子的贮存:柱子不能贮存于水或水性溶剂中,否则会引起细菌在柱中生长或产生盐类沉淀。贮存前应先用适当的溶剂(如甲醇),将柱子冲洗干净,再将柱子两头密封,以防溶剂蒸发使柱子干燥而引起柱子结构的几何学改变。