主题：【第八届原创】同一样品检测方法多种

同一样品检测方法多种

简介
        维生素B2又叫核黄素，微溶于水，在中性或酸性溶液中加热是稳定的。是体内黄酶类辅基的重要组成部分（黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用），当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。其病变多表现为嘴、眼和外生殖器部位的炎症，如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等，故本品可用于上述疾病的防治。人体内维生素B2的储存是很有限的，因此每天都要由饮食提供，食用肉制品是维生素B2的重要来源，因此动物饲料中该成分的含量就有严格要求。液相色谱法是检测该成分的重要检测方法，方法种类很多，下面就具体介绍下。
实验部分
1 原理
        准确称取适量某饲料样品，用乙二胺四乙酸二钠提取液提取，样品经进样器进入高效液相色谱系统，通过C18反相色谱柱分离，紫外检测器（或荧光检测器）检测，外标法（保留时间定性，峰面积定量）分析计算，得出结果。
2 试剂
2.1 甲醇：色谱纯
2.2 乙腈：色谱纯
2.3 磷酸二氢钾：分析纯
2.4 超纯水
2.5 维生素B2标准品：纯度：99.9±0.5%
2.6 乙二胺四乙酸二钠：分析纯
2.7 庚烷磺酸钠：分析纯
2.8 乙酸：分析纯
2.9三乙胺：分析纯

        提取液配制：在已经装入700ml去离子水的1000ml容量瓶中，加入50mg乙二胺四乙酸二钠，待全部溶解后，加入25ml乙酸5ml三乙胺，用去离子水定容至刻度，摇匀，即得。
3 仪器设备
3.1 高效液相色谱仪： 紫外检测器（荧光检测器）；柱温箱；高压恒流泵；自动进样器
3.2 电子天平：0.0001g
3.3 溶剂过滤器
3.4 超声波清洗仪
3.5 恒温水浴锅
4 具体操作
4.1 标准曲线的制备
4.1.1 维生素B2标准储备液的配制
        精密量取维生素B2 0.0100g与200ml棕色容量瓶中，加1ml乙酸在沸水浴80℃～100℃煮沸30min。待冷却至室温后，用纯水定容至刻度，此溶液4℃避光保存。
4.1.2 维生素B2标准工作液的配制
        准确吸取维生素B2标准储备液5.0ml于50.0ml的棕色容量瓶中，用流动相定容至刻度，混匀，即得。该溶液的浓度为5ug/ml
4.2 样品的配制
        精密称取某饲料样品0.5g （精确至0.0001g），置于100ml棕色容量瓶中，加入三分之一提取液于沸水浴80℃～100℃煮沸30min。待冷却至室温后，加入14ml的甲醇溶液，用提取液定容至刻度，超声波振动混匀，过滤，待测。
        样品称样量为0.5049g。
5 测定
5.1 色谱条件
检测器：紫外检测器
色谱柱：Promosil C18 250*4.6mm，5um色谱柱
检测波长：267nm
流动相：在已经装入700ml去离子水的1000ml容量瓶中，加入50mg乙二胺四乙酸二钠，1.1g庚烷磺酸钠，待全部溶解后，加入25ml乙酸5ml三乙胺，用去离子水定容至刻度，摇匀。用乙酸或三乙胺调节该溶液的pH值为3.4，滤膜过滤后，取该溶液860ml与140ml甲醇混合，脫气，待用。
流速：1mL/min
柱温：室温
进样量：10.0uL
5.2 样品测定及计算
计算公式：
样品中各物质的含量计算公式：

D----试样中维生素B2的含量，以（mg/kg）表示
V--- 试样总稀释体积，单位（mL）
P3----试样溶液峰面积值
P4-----维生素B2标准工作液峰面积值
ρ2----维生素B2标准工作液浓度。单位为ug/ml
m2----样品质量，单位（g）

5.3 标准品及样品谱图
维生素B2标准品色图谱：


空白样品测试色谱图：

饲料样品色谱图：



6 结论
        以上检测某饲料中维生素B2的方法操作简单，检出限低，结果准确、可靠。
        该方法适用检测蛋该饲料中维生素B2。
        下面我们改变下流动相看看效果。
        流动相变成0.05mol/L磷酸二氢钾：乙腈=65:35（V：V），其它条件及实验步骤不变。
维生素B2标准品色图谱：



空白样品测试色谱图：


饲料样品色谱图：




        经计算该样品中维生素B2含量为161.35mg/kg。
        该方法检测效果也不错，与上面方法相比，优点是流动相配制简单，检测时间短，检测费用相对低；缺点是分离度相对差，对于某些复杂样品准确度可能不如第一种方法（准确度也是很高的，只是相对而已）。
        下面我们再介绍种荧光检测器检测该饲料中维生素B2的方法。
        荧光检测器检测和紫外检测器检测主要就是波长选择不一样，荧光检测器检测维生素B2激发波长：λEX=470nm,发射波长：λEX=535nm，流动相0.05mol/L磷酸二氢钾：乙腈=65：35（V：V），其它色谱条件及实验步骤不变。
标准品色谱图谱


空白样品色谱谱图


饲料样品色谱图谱



        该方法检测该样品，操作也很简单，结果同样准确、可靠，维生素B2响应值更高，具有非常低的检出限。也是检测该样品非常理想的检测方法。
说明
1. 以上两种方法都适合检测饲料中维生素B2含量，效果都很好。
2. 紫外检测器检测时检测波长除了267nm以外，254nm，280nm，444nm等波长检测效果也不错。色谱柱温度一般控制在室温-35℃都可以。流动相也有很多种选择且效果也都不错，比如甲醇：水=70：30（V：V，也有选择50：50），乙腈：醋酸胺缓冲液=30:70，也有乙腈：0.008乙烷磺酸钠：三乙胺：冰醋酸=12：87：0.25：0.75，还有0.01mol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液：乙腈：甲醇=85∶10∶5等等。有时检测波长选择和流动相选择有一定相关性，否则可能会影响方法灵敏度等指标。
3. 荧光检测器检测维生素B2激发波长从400nm到500nm都有较好效果，其中470nm效果相对更好。470nm时维生素B2响应值最高，而饲料中其它成分在这个波长下响应一般都较低，这样方法检出限会更低，受干扰影响更小，检测更准确。
4. 紫外检测器较便宜，应用较广，一般实验室都有，但条件要求较高，灵敏度较低；荧光检测器不常用，价格较贵，但它的检出限更低，尤其适合微量样品检测。这两款检测器检测该样品效果都非常理想。
5. 检测不同样品，所需的最佳检测条件及检测器可能不同，检测时要根据实验室及样品及样品检测要求选择方法，争取花最小代价达到最大利益，实现最完美结果。