5.重结晶及分步结晶:在制备结晶时,最好在形成一批结晶后,立即倾出上层溶液,然后再放置以得到第二批结晶。晶态物质可以用溶剂溶解再次结晶精制。这种方法称为重结晶法。结晶经重结晶后所得各部分母液,再经处理又可分别得到第二批、第三批结晶。这种方法则称为分步结晶法或分级结晶法。晶态物质在一再结晶过程中,结晶的析出总是越来越快,纯度也越来越高。分步结晶法各部分所得结晶,其纯度往往有较大的差异,但常可获得一种以上的结晶成分,在未加检查前不要贸然混在一起。
6.结晶纯度的判定:化合物的结晶都有一定的结晶形状、色泽熔距,一可以作为鉴定的初步依据。这是非结晶物质所没有的物理性质。化合物结晶的形状和熔点往往因所用溶剂不同而有差异。原托品碱在氯仿中形成棱往状结晶,熔点207℃;在丙酮中则形成半球状结晶,熔点203℃;在氯仿和丙酮混合溶剂中则形成以上两种晶形的结晶。又如N一氧化苦参碱,在无水丙酮中得到的结晶熔点208℃,在稀丙酮(含水)析出的结晶为77~80℃。所以文献中常在化合物的晶形、熔点之后注明所用溶剂。一般单体纯化合物结晶的熔距较窄,有时要求在0.5℃左右,如果熔距较长则表示化合物不纯。
但有些例外情况,特别是有些化合物的分解点不易看得清楚。也有的化合物熔点一致,熔距较窄,但不是单体。一些立体异构体和结构非常类似的混合物,常有这样的现象。还有些化合物具有双熔点的特性,即在某一温度已经全部融熔,当温度继续上升时又固化,再升温至一定温度又熔化或分解。如防己诺林碱在1760C时熔化,至200℃时又固化,再在2420C时分解。中草药成分经过同一溶剂进行三次重结晶,其晶形及熔点一致,同时在薄层层析或纸层层析法经数种不同展开剂系统检定,也为一个斑点者,一般可以认为是一个单体化合物。但应注意,有的化合物在一般层析条件下,虽然只呈现一个斑点,但并不一定是单体成分。例如鹿含草中主成分为高熊果砍,异高熊果甙极难用一般方法分离,经反复结晶后,在纸层及聚酞胺薄层上都只有一个斑点,易误认为单一成分,但测其熔点在115~125℃,熔距很长。经制备其甲醚后,再经纸层层析检定,可以出现两个斑点,异高熊果甙的比移值大于高熊果甙。又如水菖蒲根茎挥发油中的α一细辛醚和β一细辛醚,在一般薄层上均为一个斑点,前者为结晶,熔点63℃,后者为液体沸点296℃,用硝酸银薄层或
气相层忻很容易区分。有时个别化合物(如氨基酸)可能部分地与层析纸或薄层上的微量金属离子(如Cu)、酸或碱形成络合物、盐或分解而产生复斑。因此,判定结晶纯度时,要依据具体情况加以分析。此外,高压液谱、
气相层析、紫外光谱等,均有助于检识结晶样品的纯度。
C.层析法:
层析技术的应用与发展,对于植物各类化学成分的分离鉴定工作起到重大的推动作用。如中药丹参的化学成分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素,分别称为丹参酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后进一步的研究,发现除丹参酮Ⅰ为纯品外,Ⅱ、Ⅲ、均为混合结晶。此后通过各种层析方法,迄今已发现15种单体(其中有4种为我国首次发现)。目前新的层析技术不断发展,随着层析理论和电子学、光学、计算机等技术的应用,层析技术已日趋完善。
一.层析法的基本原理:
层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差(分配层析),组分对吸附剂吸附能力不同(吸附层析),和寓子交换,分子的大小(排阻层析)而分离。通常又将一般的以流动相为气体的称为
气相层析,流动相为液体的称为
液相层析。
一、 吸附层析法(AdsorptionChromatography)
(一)吸附剂、溶剂与被分离物性质的关系:液一固吸附层析是运用较多的一种方法,特别适用于很多中等分子量的样品(分子量小于1,000的低挥发性样品)的分离,尤其是脂溶性成分一一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果,决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。
1. 吸附剂:常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。
(1) 硅胶:层析用硅胶为一多孔性物质,分子中具有硅氧烷的交链结构,同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分,因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17%,吸附力极弱不能用作为吸附剂,但可作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化,当硅胶加热至100~110℃时,硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升高至500℃时,硅胶表面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键,从而丧失了因氢键吸附水分的活往,就不再有吸附剂的性质,虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较高温度进行(一般在170cC以上即有少量结合水失去)。
硅胶是一种酸性吸附剂,适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂,其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子,当遇到较强的碱注化台物,则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。
(2)氧化铝:氧化铝可能带有碱性(因其中可混有碳酸钠等成分),对于分离一些碱性中草药成分,如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应,如异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中绚碱性杂质可用水洗至中性,称为中性氧化铝。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴,本适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝,不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质,并可使氧化铝颗粒表面带有NO3一或CI一的阴离子,从而具有离于交换剂的性质,适合于酸性成分的层析,这种氧化铝称为酸性氧化铝。供层析用的氧化铝,用于拄层析的,其粒度要求在100~160目之间。粒度大子100目,分离效果差:小于160目,溶浓流速大慢,易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比,一般在1:20~50之间层析柱的内径与柱长比例在1:10-20之向。