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气相色谱分析方法的开发
我国有机物监测标准方法体系正处于发展中。对于分析人员,当接到一个分析任务时,有时没有现成的分析方法, 这就需要分析人员针对所使用的色谱仪,所要分析的样品,建立一套完整的分析方法;同时,鉴于色谱法的飞跃进展,有时分析人员对现成的分析方法需要做某些变更以改变分离效果,取得了可接受的准确度和精密度后应用于分析工作中,这就是气相色谱分析方法的开发。
1  分析过程
2.1 样品来源
在接到一个未知样品时,必须了解它的来源,分析目的,样品可能含有的组分、样品的沸点范围等,对样品有初步估计。如果样品能直接分析,根据色谱柱固定相选择合适的溶剂。非极性和弱极性柱常用溶剂为戊烷、正己烷、环己烷、异辛烷、苯、甲苯、乙醚、甲乙醚、一氯甲烷、氯仿、二硫化碳;中等极性柱常用溶剂为丙酮、醋酸、甲基-异丁基醚、乙腈;极性柱常用溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇。己烷、氯仿、苯是气相色谱最常用的溶剂。溶剂应具有较低的沸点,使其容易与样品分离。尽可能避免用水、二氯甲烷、甲醇作溶剂,它们对延长色谱柱的使用寿命不利。气相色谱能直接分析的样品必须是气体或液体,固体样品在分析前应当溶解在适当的溶剂中,而且还要保证样品中不含气相色谱不能分析的组分(如无机盐)或可能会损坏色谱柱的组分。如果样品中有不能用气相色谱直接分析的组分,或样品浓度太低,必须进行样品预处理, 采用一些预分离手段,如各种萃取技术、浓缩方法、提纯方法等。
1 .2 样品预处理
1.2.1 水中有机物的萃取
按照化合物的沸点分类可将有机物分为挥发性有机物和半挥发性有机物。从环境水样中富集分离半挥发性有机物的方法有许多, 主要有液 - 液萃取、液 -固萃取及固相微萃取等3种方法 ;对挥发性有机物的预处理方法主要有吹脱捕集法、顶空法和液-液萃取法。
1.2.2 底质和污泥有机物染物的提取
底质和污泥有机物染物的提取、预处理方法有许多, 常用的有溶剂振荡萃取、超声波萃取、微波萃取和索氏抽提等 , 依据待测样品性质及实验室条件选择合适的萃取方法。
1 .2.3 空气中有机物的解吸
空气或工业废气中有机污染物的采样大多数采用填充柱采样法, 对于某些低沸点的气态物质, 可采用低温冷凝浓缩法采样。样品带回实验室, 大多数使用有机溶剂如二硫化碳、氯仿、四氯化碳等将有机污染物解吸出来, 进行色谱分析。测定 VOCs 时, 有专门热解吸装置。
1 .3 样品的净化
对从水、底质和污泥中萃取出来的样品溶液的净化方法有多种, 一般可分为氧化铝净化、佛罗里硅土净化、硅胶净化、凝胶渗透色谱净化几种类型。按照目标化合物的性质及使用的分析方法不同,可以针对性地应用其中的一种或多种净化方法。
1 .4 确定仪器配置
样品经过预处理及净化,就可以利用气相色谱仪进行分析,要完成分析 , 需要确定仪器配置, 即用于分析样品的方法所采用的进样装置及进样方式、载气、色谱柱、检测器。
1 .4.1 进样装置及方式
依据分析目的、样品性质以及所选色谱柱,选择合适的样品引入装置(自动进样器或手工进样器),合适的进样口及进样方式。所用色谱柱为填充柱或大口径毛细柱,则选择填充柱进样口;若所用色谱柱为毛细柱, 选择分流/不分流进样口。若使用高档气相色谱仪 ,为获得良好的分析结果 ,还可选用冷柱上进样、程序升温汽化进样口、大体积进样、阀进样、顶空进样、裂解进样等。基层监测站最常用的是分流/不分流进样口。分流进样适合于大部分可挥发样品, 包括液体和气体样品 ,特别对一些化学试剂的分析;毛细管 gc 的方法开发过程中,首选分流进样;对于脏的样品, 采用分流进样;在分流进样不能满足分析要求时(如灵敏度太低),考虑其他进样方式。不分流进样是分析高沸点痕量组分首选方法。
1 .4.2 色谱柱类型
色谱柱的选择是确立监测分析有机污染物方法的关键。色谱柱包括填充柱和毛细柱。几乎每一本关于气相色谱的书都讨论了优选色谱柱的原则。本文只讨论基层监测站在实际工作中选择毛细管柱该考虑固定液，也是选择色谱柱最主要的，固定液种类繁多，但基层监测站基本有OV-1、SE-54、OV-17、PEG-20M这四根柱，尽管不同厂家柱牌号不同，OV-1柱适用于分析脂肪烃化合物，石化产品；SE-54柱适用分析各类弱极性化合物及极性组分混合物；OV-17柱适用分析极性化合物，如农药等；PEG-20M柱适用分析极性化合物, 如醇类, 羧酸酯等。另外柱内径越小,分离效率越高,完成特定分离任务所需的柱长越短;细的色谱柱容量小,容易超载;同样内径的毛细柱液膜厚度越大,柱容量越大,这些也都是色谱柱选择选择时该考虑的问题。
1.4.3 选择载气
气相色谱法最常用的载气是氢气、氮气、氦气。在气相色谱中选用何种载气及多高的纯度,主要取决于所用的检测器和色谱柱等分析条件。一般要求纯度在99.99 %以上;用ECD 检测器需要把电负性较强的组分除去,特别是氧的含量要尽量低,岛津、瓦里安等仪器提供了氧肼;FID 检测器中的烃类有机物要除去。
1.4.4 选择检测器
商品检测器有多种, 但基层监测站基本有FID、ECD、NPD(TSD)3种。FID适用于各种有机物的分析;对碳氢化合物的灵敏度高。离子数目正比于碳原子数目(C-H 键),一些官能团如(C=)、羟基(-OH)、卤素(-X)、胺(-NH₄⁺)则很少或根本不会离子化,, 对无机气体如H2O 、CO2、SO2 、NOX不灵敏。ECD适用于分析含电负性元素或基团有机物的分析。只对含S 、P、卤素的化合物、金属有机物及含羰基、硝基、共轭双键的化合物有输出信号。TSD适用于含N 、P有机物的分析,含N 化合物的响应值与结构有以下顺序关系:N =N -> -CN >氮杂环>芳香胺>硝基化合物>R-NH2> RCONH2
2  确定初始操作条件
主要包括进样口温度、检测器温度、色谱柱温度和载气流速。分流进样的进样量一般不超过2μL ,最好控制在 0 .5 μL 以下 ,进样量还和分流比有关 ,分流比大时 ,进样量可大一些 ;进样口温度应接近或高于样品中最重组分的沸点 ;对于一个未知的新样品, 可将进样口温度设置为 300 ℃;常用毛细管gc 所用柱内载气线流速为:氮气 20～40 cm/s。隔垫吹扫设定为 2 ～5 mL/min , 分流比依据样品情况(如待测组分浓度等)、进样量大小和分析要求来改变, 选择一个合适的折衷分流比,用分流比范围 20∶1 ～200∶1 ,待测组分浓度大或进样量大时, 分流比可相应增大,反之则减小,用大口径柱时分流比小一些,用微型柱做快速gc 时,分流比要求很大,流比小时, 分流歧视效应可能小,但初始谱带(主要是溶剂谱带)宽度大,分流比大时,初始谱带(主要是溶剂谱带)宽度小,但分流歧视效应可能大。检测器温度可参照色谱柱的最高温度设定,而不必优化。色谱柱温度,组成简单的样品最好用恒温分析;组成复杂的样品,常需要用程序升温分离;色谱柱的初始温度应接近样品中最轻组分的沸点, 最终温度取决于最重组分沸点;升温速率依样品的复杂程度而定,建议毛细管柱的尝试温度条件设置为OV -1或SE-54 柱 :从 50 ～280 ℃,升温速率 10 ℃/min ,V - 17(OV -1701)柱:从60 ～260 ℃, 升温速率 8 ℃/ min ,PEG -20M 柱:从60 ～200 ℃,升温速率 8 ℃/ min 。这是方法开发时的初始参考条件,具体工作中再根据样品的实际分离情况来优化设定。
3  尝试性分析
上述初始条件设定后,便可以进行样品的尝试性分析。一般先分离标准样品,然后分析实际样品。在此过程中,还要根据分离情况不断进行优化。gc的分离优化就是要在保证分离度和灵敏度的前提下,实现快速分析。在实际工作中,一般是首先满足分离度的要求,然后提高分析灵敏度,最后再考虑尽可能缩短分析时间。改变柱温和载气流速可改变分离度;内径越小,或者填料粒度越小,柱效越高;薄液膜色谱柱的柱效高于厚液膜柱;更换色谱柱可改变分离度;用化学作用如通过生化反应改变待测物结构;程序升温是gc分离复杂混合物的有效方法;进样量小一些、进样口温度高一些、载器气流速快一些、汽化室体积小一些,分流比大一些,对窄的初始谱带宽度有利。
4  气相色谱定性与定量分析
对于简单的样品,可通过标准物质对照来定性。对于复杂的样品, 则要通过保留指数定性和或gc/MS来定性。对于基层监测站,气相色谱定性分析最主要是依据保留值定性,即在相同的条件下,分别注入标准样品和实际样品,根据保留值确定色谱图上哪个峰是要分析的组分。但必须注意,在同一根色谱柱上,不同的化合物可能有相同的保留值,对未知样品的定性仅仅用一个保留值还不够。双柱或多柱保留指数定性是气相色谱定性分析较为可靠的方法,不同的化合物在不同色谱柱上具有相同保留值的几率要小的多。建议对复杂的样品采用双柱或多柱保留指数法定性。
气相色谱定量方法包括面积百分比法、归一化法、外标法、内标法、标准加入法。基层监测站最常用的方法是外标法,只要用一系列浓度的标准样品做出工作曲线, 就可以在完全一致的条件下对未知样品进行定量分析。需特别注意外标法定量时分析条件必须严格重现, 特别是进样量。外标工作曲线最好与未知样品同时测定,或者定期重新测定工作曲线,以保证定量准确度。有时也用内标法,找到一个合适的内标物,其保留时间和响应因子应该与待测物尽可能接近且完全分离。分别加到标准样品和未知样品中。各种定量方法峰面积均可用峰高代替。但在实际操作中,影响峰高和峰面积的因素有多种,综合考虑各种因素,峰面积定量一般比峰高定量准确一些。然而当峰未完全分离时,用峰高定量更准确一些。
5  结  语
开发一个方法后 ,必须进行可靠性验证,即定量的线性范围、检测限、方法回收率、重现性和准确度。
(1)方法的线性范围的确定通常采用一系列(多于3 个)不同浓度的样品进行分析, 以峰面积(或峰高)对浓度进行线性回归。当相关系数大于0 .99 时 ,可认为是线性的。
(2)原则上检测限按照3 倍信噪比计算,一般测定用一个接近检测限浓度的样品进行分析。

DL= 3 Nc/ h

式中:DL —检测限; c —此时浓度;h —相应峰高;N —基线噪声。
作为分析方法,检测限越低越好,应选择灵敏度高的检测器,高纯载气和辅助气, 定期维护仪器,保持进样口和检测器的清洁, 保持色谱柱性能。
(3)环境监测中样品一般都经过样品前处理,必须考虑整个方法回收率 ,一般要回收率大于60%。
(4)对于方法开发人员来说, 必须测定重复性,即在相同条件下连续进样 5 -10 次 ,统计待测组分的保留时间和(或峰高)的相对标准偏差,一 般要求保留时间, 峰面积的相对标准偏差不大于5%。