主题：【原创】留住色谱柱的“青春”——说说那些延长毛细管色谱柱寿命的事儿

      虽然色谱柱没有生命，但是作为实验人员我们还是希望一根色谱柱可以尽可能的耐用，一方面减少检验成本，另一方面则可以减少因为频繁更换色谱柱产生的检测结果波动。但是为了延长毛细管色谱柱的寿命应该注意哪些问题，如果出现了柱流失又应该怎样判断与减少呢？今天就和大家聊聊这方面的事儿。
通常影响色谱柱使用寿命的主要因素有：
①色谱柱破损
      石英毛细管柱的聚酰亚胺层，如有少许破损就很难再保护脆弱的石英毛细管。当柱箱连续地加热和冷却、柱箱风扇的震动和柱架等都会对毛细管造成应力，最终在色谱柱有弱点处破裂。大内径柱更容易破裂，也就是说，在操作0.45～0.53mm内径柱时，要比0.18～0.32mm内径柱更要小心。
      如果已经断裂的色谱柱，仍在高温下连续运行或是作多阶温度程序运行，很可能损坏色谱柱，因破裂的后半段暴露在高温的氧气中，这样会很快地破坏固定相；而断裂的前半段，由于有载气流过，氧的影响会小些。如断裂的色谱柱没有再加热或只暴露在高温或空气中很短时间，断裂的后半部分不会受到明显损坏，可考虑作为它用。
②热损伤
      超过色谱柱温度上限，会造成色谱柱固定相和管表面加速损坏，色谱柱的过量流失会使活性组分拖尾，降低柱效。一般热损坏是一个很慢的过程，但有氧存在时，会大大加速热损坏。
      另外在有漏气情况下，色谱柱过热也会加速损坏或永久性损坏色谱柱。
③氧损伤
      氧是毛细管柱的大敌，在接近室温下，不会对色谱柱有太大损害，柱温升高时会严重损坏色谱柱。对于极性固定相，即使温度和氧浓度很低时，也会发生严重损坏。虽然，短时间地暴露在空气中，如注射空气或更换隔垫不会有太大问题，但也应避免。
      在气路上有漏气的地方(如气路、接头和进样器)，往往是进入氧气的源头，当色谱柱加热时，就会很快地损坏固定相，会过早地引起固定液的过度流失，至使活性化合物有拖尾，降低柱效。在不太严重的情况下，色谱柱还会有一定的分离功能，但柱效已经下降。在严重的情况下，色谱柱就会完全失效。
④化学损伤
      有少数化合物会使固定相遭到破坏。不挥发性化合物，进入色谱柱常常会降低色谱柱的性能，但是不会破坏固定相，有条件时这些沉积的残留物可以用溶剂冲洗而除去，能恢复色谱柱的性能。
      要避免进入色谱柱的主要化合物是无机和矿物碱和酸，这些矿物碱和酸不会挥发，通常积累在色谱柱的前端，如果使其停留在那里就会破坏固定相，使色谱柱过早的大量流失，使活性化合物拖尾，以及使柱效下降，其征兆和热损坏及氧损坏类似。
      由于化学损坏多发生在色谱柱的前端，所以可把色谱柱的前端切掉0.5～1m，在比较严重的情况下，可以截去 5m 或更长的一段。如果使用保护柱就会减小色谱柱被损害的长度，但是需要经常处理或更换保护柱。酸或碱还常常会破坏石英管内的去活表面，因而会引起活性化合物的峰形变坏。
⑤污染
      气相色谱中，毛细管色谱柱被污染是很普遍的问题，不幸的是，它和各种各样常见的故障相似，常常被错误的判断为其它的故障，虽然被污染了的色谱柱并没有损坏，但已失去效能。通常有两种基本类型的污染物，不挥发性污染物和半挥发性污染物。不挥发性污染残留物不能从色谱柱里洗脱出来，而是累计在色谱柱里，这样它就成为涂渍了残留物的色谱柱，因而影响溶质的分配。而且残留物还会和活性化合物相互作用，甚至造成峰的拖尾，减少峰面积。
      活性溶质是指那些含有羟基或氨基(一些硫醇基)及醛的物质；半挥发性污染物最后会洗脱出去，但需要几个小时或几天时间，半挥发性污染物和不挥发性残留物一样，他们也会引起峰形变坏和峰面积减小。此外，还常常引起基线不稳定(漂移、噪音增加)或出鬼峰等。
      污染物的来源有许多，其中进样是最主要的来源。生物液体和组织、土壤、废水、地下水和类似的含有大量半挥发的和不挥发物质的基体，甚至使用净化方法，样品也会含有少许这些物质并带到注射样品中，几次到几百次进样就会造成残留物的积累故障。柱上进样、不分流进样和大口径柱直接进样等进样方法常常会造成上述色谱柱的严重污染。
      污染物还会来源于气体管路、净化器、密封垫、隔垫的碎屑或其他与样品可能接触的物质，如样品瓶、溶剂、注射器、移液管等，这些类型的污染物可能会突然性的引起故障。
怎样减少以上问题？
①正确的安装和操作
      气相色谱柱一旦受到损伤之后，想恢复其分离效能往往是极其困难的，因此要使一根气相色谱柱能够获得更长的使用寿命，最根本的是在于能够正确的安装和操作，形成良好的使用和维护习惯。如定期对管路和压力调节器进行检漏、定期更换隔垫、用高纯度载气、安装氧净化器以及不要待载气钢瓶完全用空再进行更换等，以免系统和氧          接触而受氧化损坏；严格和彻底的净化样品，以减少半挥发性和不挥发性残留物对色谱柱的污染。
②使用预柱
      为了延长色谱柱的寿命，除合理选择柱类型和固定相外，减少柱的活化或再生频率，提高日常工作效率，是较佳的方法。有时使用预柱是不可缺少的。
      在毛细管气相色谱分析中，可以使用一段1～10m的去活石英毛细管作为预柱，减少污染物对色谱柱的损伤。这段去活石英毛细管又被称为空保护柱，它连接在毛细管柱前面。去活石英管没有涂渍任何固定相，只是对管壁表面进行了去活处理，以便减小和溶质的作用，大多数的情况下，空保护柱内外径和色谱柱相同，如果管径不同，最好使用内外径大一些的保护柱，要比使用直径小的效果更好。
      当样品中含有不挥发组分时，使用保护柱可免污染色谱柱，这样可以大大减少残留物和样品之间的作用。因为空保护柱不会保留溶质(没有涂渍固定相)，且残留物不会覆盖在固定相的上面而导致不好的峰形。空保护柱常为3～5m长，当有峰形出现问题时，保护柱应当进行再处理或更换了。
      空保护柱也常用于某些样品，以改善峰形。在大体积进样(>2μL)的不分流进样、大内径柱直接进样和柱头进样情况下，对溶剂和固定相极性不匹配时很有用，它对靠近溶剂前沿流出的峰或溶质的极性和溶剂很相似时色谱峰，会有很大改善。
      当色谱柱使用一段时间以后，柱内由于各种原因，滞留了一些高沸点组分或氧化物等，除柱效有所下降外，还可能出现基线波动或“鬼峰”。为了去除污染物，使柱效和基线恢复到原来的状态，称为色谱柱的再生。色谱柱的再生和柱老化有一定区别和不同，它是柱在使用一段时间柱性能下降，经处理后尽量恢复到原来性能的过程。
a.色谱柱在以下几种情况必须再生处理：
i.使一段时间，柱效明显下降；
ii.柱被污染，特别是在程序升温时，基线漂移和噪声超过容忍程度或出现“鬼峰”；
iii.柱头塌陷，柱床短路或断位(在玻璃柱中容易发现)，而出现尖峰或双重峰；
iv.峰形展宽，保留时间明显变化；
v.待分离组分和固定相表面非特异性相互作用，引起保留时间较短的峰拖尾或出现双峰；
b.毛细管柱再生的几种方法
i.用载气将色谱柱污染物冲洗出来；
ii.将柱头截去100mm 或更长一些；
iii.若使用交联的色谱柱，可在仪器上反复注射溶剂进行冲洗。常用的溶剂依次为丙酮、甲苯、乙醇、氯仿和二氯甲烷，每次可进样5～10μL；
iv.交联柱在仪器上冲洗无效时，可把柱拆下来用二氯甲烷或氯仿冲洗，溶剂用量视柱的污染程度而定，一般20mL 左右。
c. 色谱柱再生前应注意的问题
      当分析出现问题时，不能只考虑是柱问题，而马上进行再生。除上述情况外，还应考虑样品处理、进样技术、操作有无失误、数据处理参数有无改变等可能带来的问题。
i.衬管、预柱和检测器被污染也会引起基线不稳定、出现“鬼峰”或裂解峰；
ii.新的注射垫也会引起基线漂移和出现“鬼峰”；
iii.衬管密封欠佳、柱安装死体积或检测器固有特性也会引起较早出现峰的拖尾；
iv.分析系统发生变化(如漏气严重)也可能使保留时间突变；
v.峰变宽，除柱效下降外也可能由柱外效应引起；
vi.进样量太大也会引起峰变宽、拖尾或保留时间变短；
vii.色谱柱长时间样品过载，保留时间也会变小等。
d.色谱柱再生时应注意的几个问题
i.如前所述和色谱柱老化一样，不是温度越高越好，时间越长越好；建议不要使用长时间烘烤的方法，来处理受到污染的色谱柱，因为烘烤时，温度会把污染的残留物变成不能溶解的物质，再用溶剂清洗也无济于事；
ii.仪器在高灵敏度操作时，如：量程在1×10^-11A/mV以下，痕量分析程序升温过程中，温度升到大于180℃后，基线明显漂移是不可避免的；
iii.不同类型柱子，再生方法不同；
iv.样品种类、组分、进样量不同或操作时间长短不同，再生方法也不同；
v.仪器本身条件如：气源种类、纯度、净化条件、进样口结构和操作检测器不同，再生柱方法也有区别；
vi.高分子量组分污染色谱柱后，高温再生时间长会导致固定相的老化；使用交联或键合柱最好用溶剂漂洗再生，漂洗溶剂流动方向一定要从柱出口注入。应该注意，毛细管柱交联键合率通常不到90%，因此会漂洗掉未化学结合的液相部分，所以保留时间和分离状态会有所变化；
vii.对于难挥发物，碳化物是不能通过再生除去，对于填充柱最好使用带衬管气化室进样器，对于毛细管可通过把柱入口切去30～50cm的方法除去污物段。有条件的可以使用预柱，把不挥发的有机物、无机物和颗粒材料阻留在预柱中，需要时更换预柱；
viii.在某些情况下，色谱柱要在温度极限附近使用，这时基线漂移和大噪声已不可避免，柱的再生要求只能视情况而定；
ix.不是所有色谱柱通过再生均能恢复原来性能。对于柱效下降的柱，可以用作要求低的分析。评价色谱柱失效的标准主要有两条：分离能力与选择性已不能满足要求；基线波动和出现“鬼峰”超出了允许范围。
柱流失是什么？
        柱流失是不可避免的。柱流失程度与固定相种类和色谱柱规格有关，一般固定相的量越多，柱流失则相对较高。柱流失与柱温以及载气中氧气的浓度有关。高温下，固定相的分解会加快，因此，高温时的流失会比低温时高。
      氧气是许多固定相分解的催化剂，特别是在高温时段，强调载气的纯度和色谱柱安装的气密性，一方面就是出于氧气会加剧柱流失的考虑。
      此外，色谱柱随着使用次数和时间的增加，固定相的稳定性最终也会发生不可逆的变化，导致柱流失的增加。色谱柱柱流失严重情况多出现在进样的溶液类型，5MS的柱子是非极性的，当使用极性溶剂时，就会发生反应而导致大量柱流失，在做测试时一定要留意样品的性质。
怎么从色谱图上看出柱流失？
      诊断色谱柱是否存在流失问题的最佳方法是安装色谱柱后，在设定的条件下，做一次空白色谱图，并保存。必要时，将最近的运行和空白运行色谱图对比；如果空白运行中产生了很多峰，则色谱柱性能改变了，如果有gc-MS，则可以通过离子峰的质荷比来判断相应离子是否来自于柱流失。

表1  gc/MS常用毛细管柱的柱流失碎片离子

      柱流失会随着温度的升高加剧。我们可以通过流失曲线或图清楚地看到这种变化。一般我们会在程序升温的条件下做一次空白试验，温度要升至色谱柱的温度上限，并持续该温度10～15分钟，这样就可以得到该色谱柱的正常流失曲线图。
      从流失图中我们可以得到几个重要的指标。空白试验的基线在较低温度区域相对平坦，到离温度上限30～40℃时开始急速地上升，直至达到温度上限。在上限温度持续期间，基线又变得平稳许多。几分钟后基线会又变得完全平坦。如出现明显或严重的偏差，则应不是由于色谱柱流失引起的。色谱柱的流失是一种持续的过程—并不会偶然地开始，也不会突然地停止。
      如果在空白试验中得到了色谱峰，这一般情况下并不是由于柱流失而引起的。使用质谱检测器进行检测并与谱库对照，您会发现它们是一些含硅的化合物，它们的来源极有可能是进样垫。
      柱流失一般表现为随着温度的升高基线产生偏移的情况，一般不会有峰出现，除非是因为进样问题引起的柱流失才会出现比较明显的峰，如进了水样，柱子的固定相会因为水的作用而比较多的流失出来而形成峰，隔垫流失一般会出现呼吸峰，即出峰时间间隔相同的峰，那种等间距的峰是聚合物热裂解的特征峰形。要判断是不是隔垫流失很简单，只要降低进样口温度再进样，如果峰消失，则说明很有可能是隔垫流失，如果还有峰出现，说明不是隔垫流失造成的。
        一般来说，极性固定相的流失率较高，较低温度下，它们的流失就已很明显。如果你使用的检测器对固定相中任何原子或功能团有特别灵敏的响应，那么柱流失就非常明显了。就算柱流失不是很严重，但由于检测器对柱内降解产物有较灵敏的响应，会导致很强的基线噪声。在氰丙基取代聚硅氧烷固定相与NPD系统或聚乙二醇柱与ECD系统中，这种现象就很突出。由流失图中我们可以看到，在高温区域柱流失会迅速升高。
      当流失率增高时，我们无法用一种绝对的方法去测量指示。柱流失最佳的测量方法是测量在两种温度下背景倍号的不同或改变。通常我们会选择色谱柱的温度上限和100℃这两个点，绝对的背景信号通常是整个gc系统背景的组合，我们不可能测量出柱流失对这个信号有多大的贡献。
      而测量柱流失的相对数量，其它对背景信号有贡献的因素也就被减去了。大多数的色谱柱是通过FID进行检测的。FID的输出信号为10^-12安培(pA)。流失水平就是在两种温度下FID信号值的差(ΔpA)。由于这些数值随检测器响应的变化而变化，所以只有在相同的实验条件下使用同一个检测器，或者在标准的流量条件下使用相同标准的检测器，并且流失数值以pgc/克固定相来表示，这样做的数据才真实有效。
      随着色谱柱的使用，柱流失会不断地升高。色谱柱暴露于有氧环境(空气)中和／或持续在等于或接近色谱柱的上限温度条件下被使用，都会加速色谱柱的流失。柱流失突然或快速的升高则可能是色谱柱有损坏或gc系统有问题出现。而持续在高于色谱柱上限温度下操作使用，持续使色谱柱暴露于有氧环境中(通常由于泄漏)，或者不断分析的样品中有破坏性物质，这些都可能是问题的原因。
      色谱柱温度极限：一根色谱柱通常有两个温度极限，温度下限和温度上限。如果在低于温度下限的条件下实验，得到的色谱峰又圆又宽(柱效降低)。但是色谱柱并不会受到什么损坏。这样并不能发挥色谱柱的正常功能。在达到下限温度或者高于下限温度时，得到的色谱峰会有明显的好转。
      温度上限—般有两个固定的数值。较低的是恒温极限，在该温度下色谱柱可以正常地使用，柱的寿命不会受到影响。较高的数值是程序升温极限，在此温度下色谱柱使用时间如果在10～15分钟内，色谱柱的流失和寿命不会受到太大的影响。但如果持续时间过长，则会增加色谱柱的流失，缩短色谱柱的寿命，固定相和熔融石英管的惰性都有可能被破坏。
如何减少柱流失？
减少色谱柱固定相流失的主要措施有：
①尽量使用高纯气体（纯度99.999%以上）作为载气；
②注意载气的净化，除去载气中的氧和碳氢化合物；
③所有气路中的材料和密封件最好为金属件（不含石墨垫、衬管和色谱柱），以防长期使用中漏气；
④经常检查确保毛细管柱系统的密封性，以防氧和其它物质对柱的污染；
⑤柱的使用温度尽可能低；选择柱温时，首先要保证不得超过仪器和固定相的使用温度极限，其次再根据样品组分沸点调节柱温。对于组分简单的样品，在保证组份充分分离前提下，一般采用低于样品的平均沸点10～40℃的柱温。对于组分复杂的样品，应采用程序升温的方式，初温越高越好，终温以低于组分中最高沸点10～20℃为宜。
⑥为预防难挥发性物质进入色谱柱，应该进行：a.进行样品预处理；b.使用填有石英棉的衬管；c.安装预柱等。