基于矿质元素指纹分析的原产地葡萄酒判别研究
自2002年以来，我国先后批准了对昌黎葡萄酒等19个葡萄酒产品实施地理标志保护（或原产地标记保护）。目前，尽管所有地理标志葡萄酒均对其产地范围和产品质量技术要求（包括立地条件、品种结构、栽培管理、采收质量、酿造工艺及质量特色）做了严格规定，但现行之葡萄酒地理标志管理体系内缺乏相关产地鉴别的措施和标准。对葡萄酒原产地的准确判别技术理应是葡萄酒地理标志管理体系的必要组成部分，也是预防和打击造假的有效措施，同时为维护消费者和合法生产者的权益提供切实保障。
无机元素“指纹”分析技术是广泛应用于农产品产地判别溯源的重要手段之一。目前，利用该技术进行葡萄酒原产地判别的研究正在国外如火如荼地进行，相关文献报道不断涌现。一些葡萄酒发达国家如西班牙、澳大利亚、意大利、南非、阿根廷及斯洛文尼亚等的研究人员已甄别出可以用来描述和区别不同原产地葡萄酒的特征无机元素。如Gonzálvez等利用电感耦合等离子体光谱仪测定了分属西班牙乌迭尔-雷格纳、胡米亚、耶克拉、瓦伦西亚等4个葡萄酒原产地保护区的67个酒样中的38种矿质元素，继而通过多种化学计量学方法成功区分了上述4个产地，其中乌迭尔-雷格纳和胡米亚产区分别仅通过Li和Mg的浓度即可辨识；Castiñeira等借助电感耦合等离子体质谱仪研究了来自德国4个法定产区（巴登、莱茵高、莱茵黑森及法尔兹）127个酒样中的13种矿质元素，并通过决策树法分析数据，结果发现仅用Li、Zn、Mg、Sr等4种元素即可有效判别上述产地的葡萄酒。较其它葡萄酒发达国家，我国葡萄酒原产地保护研究工作起步较晚，在以无机元素判别葡萄酒原产地的领域还多停留在检测葡萄与葡萄酒中的元素含量上，真正涉及原产地判别的工作还很少。本研究通过测定贺兰山东麓、沙城、通化及云南红等4个原产地葡萄酒中多种矿质元素的含量，并结合化学计量学方法对其加以研究，探讨矿质元素“指纹”分析技术对我国不同原产地葡萄酒产地判别的可行性。
1 材料和方法
1.1 材料
本研究中所有供试酒样分属于贺兰山东麓葡萄酒（质检总局公告2011年第14号，下同）、沙城葡萄酒（2002年第125号）、通化山葡萄酒（2005年第186号）及云南红葡萄酒（2002年第108号）等4个地理标志（或原产地标记）保护产品，取样方式为酒庄（厂）现场取样。葡萄品种、酿造工艺及产品质量要求均符合地理标志保护（或原产地标记）的相关规定，每个原产地的样品数量均为20，年份跨度2012-2015（见表1）。

表1 原产地葡萄酒样品基本信息

Table 1 Basic information of wine samplesfrom different geographical origins

原产地 Origin	品种 Variety	年份 Vintage	残糖（g/L） Residual sugar	酒度（%, v/v） Ethanol	数量 Number
贺兰山东麓葡萄酒/HL	赤霞珠、美乐、品丽珠、蛇龙珠	2012-2015	2.3-3.6	12.5-14.8	20
沙城葡萄酒/SC	赤霞珠、美乐、品丽珠、蛇龙珠	2012-2015	1.9-3.4	12.4-13.8	20
通化山葡萄酒/TH	双优、双红、北冰红、公酿1号	2012-2015	2.3-3.5	11.0-12.3	20
云南红葡萄酒/YNH	玫瑰蜜、赤霞珠、美乐、法国野	2012-2015	1.4-3.1	11.2-12.2	20

1.2 试剂和仪器
Bi、Ce、Cs、Eu、Ga、La、Li、Mg、Rb、Sb、Sm、Sr、Tl、U及Zr等15种元素标准溶液（10 mg/L，介质为0.5%HNO₃/2%HCl/1%HF）购自加拿大SCP SCIENCE公司；优级纯硝酸（北京化学试剂研究所）；去离子水（18.2 MΩ∙cm，美国Millipore公司）。Anton PaarMultiwave 3000微波消解系统（奥地利Anton Paar GmbH公司）；PerkinElmer ICPMS Elan DRC-e型电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS），配备40.68MHz自激式射频发生器（美国PerkinElmer公司）；LabTech EHD36电热消解板（北京莱伯泰科仪器公司）。
1.3 试验方法
1.3.1样品前处理方法实验中所有玻璃器皿和聚四氟乙烯微波消解管用前均经30%硝酸溶液浸泡过夜，再经去离子水润洗3次以上烘干备用。样品前处理参考Geana等的方法并做改进，准确量取5.0 mL酒样于微波消解管中，在100 ℃电热板上赶乙醇并浓缩至2 mL，加浓硝酸1.5 mL进行微波消解（功率：1000W；压力：200 psi；温度：190 ℃；爬升时间：20 min；保持时间：5 min），结束后消解液在100 ℃赶酸至2.0 mL，再用2%硝酸定容至25 mL，待测。相同方法准备试剂空白。
1.3.2 ICP-MS测定条件仪器预热后经调谐液（Ba、Cd、Ce、Cu、In、Mg、Pb、Rh及U，10 μg/L）调节至最佳状态，射频功率：1100W；等离子气流量15 L/min；载气流量：0.94 L/min；辅助器气流量：1.2 L/min；透镜电压：6.0 V；采样流量：0.8 mL/min；校正方程：仪器软件推荐。外标法定量，以2%硝酸为介质，将元素标准溶液逐级稀释并绘制标准曲线（线性范围：0.25、0.5、1.0、5.0、10.0及50.0 ppb）。Y标准溶液作内标（10 ppb），通过内标管在线加入。国家标准物质大米（GBW10010）为质控样。
1.4 数据处理
采用SPSS 17.0for Windows软件对数据进行方差分析、Duncan’s多重比较分析、主成分分析及逐步判别分析。
2 结果和分析
2.1 原产地葡萄酒中矿质元素的地域分布差异分析
Bi、Ce、Cs、Eu、Ga、La、Li、Mg、Rb、Sb、Sm、Sr、Tl、U及Zr等15种矿质元素在4个原产地葡萄酒样品中均有检出，尽管部分元素含量的标准偏差比较大，但方差分析结果显示，所有被测元素在地域间均存在显著性差异（P < 0.05，下同）（表2）。进一步的多重比较结果发现，Cs、Li、Sr、La、Li、Bi、Ce及Eu等8种元素在各个原产地葡萄酒间的差异更明显。其中，Cs在4个原产地葡萄酒中的含量差异均达显著水平，即云南红>沙城>通化>贺兰山东麓；Li含量最高的是贺兰山东麓，分别是沙城、通化、云南红的3、27、23倍；贺兰山东麓和通化的Sr含量相当，是沙城和云南红的1.6和2.6倍；在4个原产地中，云南红样品中的La和Ce含量最高，是沙城的近4倍，贺兰山东麓的近7倍；对于Tl、Bi及Eu含量，在通化样品中均为最高，云南红次之，沙城和贺兰山东麓最低。由此可见，不同原产地葡萄酒中的矿质元素分布有其各自的特征。

表2 不同原产地葡萄酒中矿物元素含量(μg/L)

Table 2 Elemental concentrations in winesfrom different geographical origins

元素 Element	贺兰山东麓 HL (n = 20)	沙城 SC (n = 20)	通化 TH (n = 20)	云南红 YNH (n = 20)
Li	138.688 ± 29.272c	45.837 ± 21.253b	5.125 ± 2.437a	5.867 ± 1.661a
Rb	868.799 ± 396.633a	1737.315 ± 370.219b	1026.536 ± 224.815a	1747.380 ± 973.490b
Sr	2117.066 ± 392.312c	1280.034 ± 481.129b	2115.258 ± 479.396c	787.041 ± 419.658a
Sb	0.235 ± 0.058a	0.208 ± 0.055a	0.341 ± 0.103b	0.320 ± 0.144b
La	0.037 ± 0.016a	0.069 ± 0.116ab	0.180 ± 0.216bc	0.267 ± 0.303c
Tl	0.098 ± 0.021a	0.086 ± 0.020a	0.162 ± 0.035c	0.126 ± 0.049b
Bi	0.139 ± 0.052ab	0.116 ± 0.058a	0.314 ± 0.030c	0.208 ± 0.215b
U	0.079 ± 0.137a	0.039 ± 0.048a	0.101 ± 0.096a	0.339 ± 0.644b
Ce	0.078 ± 0.030a	0.136 ± 0.216ab	0.347 ± 0.423bc	0.479 ± 0.544c
Mg	151019.9 ± 21284.1b	138427.8 ± 17933.8b	95179.5 ± 37276.6a	93560.1 ± 13259.8a
Sm	0.042 ± 0.011a	0.053 ± 0.028a	0.109 ± 0.063b	0.102 ± 0.075b
Eu	0.024 ± 0.006a	0.031 ± 0.010ab	0.049 ± 0.027c	0.038 ± 0.016b
Cs	1.540 ± 0.543a	4.431 ± 1.567c	2.886 ± 1.900b	6.219 ± 2.614d
Zr	1.475 ± 1.117a	1.379 ± 0.645a	2.705 ± 1.468b	3.656 ± 2.397b
Ga	2.517 ± 0.572a	2.977 ± 0.545a	4.718 ± 3.304b	3.223 ± 1.056a

注：表中数据均为平均值±标准偏差；不同小写字母表示有显著性差异 (P < 0.05)。
Note: The data represent mean ±S.D.; Different small letters represent significant difference (P < 0.05).
2.2 原产地葡萄酒中矿质元素的主成分分析
对不同原产地葡萄酒中差异显著的15种矿质元素含量数据标准化（Z-score）处理后，进行主成分分析。结果表明，前5个主成分的累计方差贡献率达到85%以上，即说明这几个主成分已经涵盖了原有15种元素的绝大部分信息（表3）。其中，第1主成分的方差贡献率为38.372%，主要集中了Sm、La、Ce、Zr、Sb、Tl、Eu、Li及U等元素的含量信息，第2主成分的方差贡献率为16.755%，主要集中了Rb、Cs及Sr的信息，第3主成分的方差贡献率为13.585%，主要代表Ga和Bi的信息。

表3 前5个主成分的载荷矩阵及方差贡献率

Table 3 The component matrix and cumulative contributionof variance of the first five principle components

元素	主成分 Principle component
Element	1	2	3	4	5
Li	-0.615	0.495	0.274	0.262	0.217
Rb	-0.009	-0.798	0.095	-0.109	0.504
Sr	-0.209	0.748	-0.327	0.059	0.355
Sb	0.745	0.228	0.060	-0.407	0.309
La	0.854	0.143	0.420	0.103	-0.042
Tl	0.707	0.308	-0.152	-0.489	0.271
Bi	0.418	0.299	-0.545	-0.386	-0.007
U	0.569	0.006	0.358	0.278	-0.049
Ce	0.825	0.164	0.424	0.058	-0.035
Mg	-0.467	0.385	0.385	0.348	0.484
Sm	0.907	0.126	0.032	0.278	0.047
Eu	0.673	-0.044	-0.493	0.522	0.081
Cs	0.386	-0.765	0.078	0.029	0.344
Zr	0.787	0.143	0.236	0.091	-0.181
Ga	0.332	-0.131	-0.764	0.496	0.072
方差贡献率 Variance (%)	38.372	16.755	13.585	9.690	6.669
累计方差贡献率 Cumulative variance (%)	38.372	55.127	68.713	78.402	85.071

根据各矿质元素载荷大小，筛选对各主成分贡献较大的元素，并利用前3个主成分的标准化得分作3-D散点图（图1）。由图可知，第1主成分可将通化与贺兰山东麓和沙城，或将云南红与贺兰山东麓区分开，主要是因为云南红和通化样品中有着较高含量的Eu、Tl、Sb、Zr、Ce、La及Sm，同时较低含量的Li；第2主成分可将贺兰山东麓与其他区域分开，主要是因为贺兰山东麓葡萄酒中有着最高的Sr和最低的Cs含量；第3主成分可将通化与云南红分开，主要是因为两者的Ga和Bi含量差异较大。不同原产地葡萄酒样品的区域分布与相关元素含量差异性基本一致。

2.3 原产地葡萄酒中矿质元素的逐步判别分析
为了进一步明确各矿质元素在原产地葡萄酒产地判别中的作用和效果，对地域间差异显著的15种矿质元素进行逐步判别分析。在Wilks’ Lambda逐步判别分析中，依据F统计量因子选择变量来构建判别函数，默认引入变量的F标准值是3.84，剔除变量的F标准值是2.71，Zr、Li、Sr、Cs及Mg等5种对产地判别作用显著的矿质元素先后被引入判别模型中（表4）。利用表4中建立的判别模型对原产地葡萄酒样品进行归类，同时结合“留一法”交叉检验法对所建模型之有效性进行验证。结果显示，不同原产地葡萄酒样品的整体产地判别效果理想，其回代检验和交叉检验的整体正确判别率分别为98.8%和96.3%。其中对贺兰山东麓和沙城葡萄酒样品的判别效果最佳，回代和交叉检验的正确率均为100%，通化样品的在回代检验中的正确率也达100%；云南红样品在回代和交叉检验中有个别样品被误判为沙城，致使其正确判别率稍低。利用判别分析给出的3个典则判别函数得分做3-D散点图（图2），从图中可以清晰直观地看出4个原产地葡萄酒样品均有其各自的空间分布特征，与主成分分析结果基本一致。

表4 贺兰山东麓、昌黎、通化及云南红原产地葡萄酒的判别分析结果

Table 4 Classification results of wine samples from HL, SC, TH and YNH

			预测组别 Predicted Group Membership				总体 Total
			贺兰山东麓 HL	沙城 SC	通化 TH	云南红 YNH	总体 Total
回代检验 Original	计数 Count	HL	20	0	0	0	20
		SC	0	20	0	0	20
		TH	0	0	20	0	20
		YNH	0	1	0	19	20
	正确率 Accuracy/%		100.0	100.0	100.0	95.0	98.8^a
交叉检验 Cross-validated	计数 Count	HL	20	0	0	0	20
		SC	0	20	0	0	20
		TH	0	1	19	0	20
		YNH	0	2	0	18	20
	正确率 Accuracy/%		100.0	100.0	95.0	90.0	96.3^b
判别模型 Discriminative Model	Y_HL= -14.707 - 1.177Zr + 16.305Li - 1.169Sr - 1.236Cs + 0.481Mg
	Y_SC= -2.958 - 0.979Zr - 0.117Li - 2.578Sr + 0.596Cs + 2.627Mg
	Y_TH= -8.746 + 0.741Zr - 10.220Li + 5.716Sr - 1.312Cs - 2.917Mg
	Y_YNH= - 6.255 + 1.415Zr - 5.968Li - 1.968Sr + 1.952Cs - 0.191Mg

注：上标a表示回代检验的总体正确判别率；上标b表示交叉检验的总体正确判别率。
Note: A superscript “a”indicates the percentage of original grouped cases correctly classified; A
superscript “b” indicates the percentage of cross-validated grouped casescorrectly classified.

3 讨论
以地理标志或原产地命名葡萄酒是世界范围内达到广泛共识的葡萄酒产品保护制度，既是对葡萄酒的知识产权保护，同时也是对其产品品质及特性风格的承诺，本研究中所选的4类产地葡萄酒是我国较早实施原产地保护的葡萄酒产品，在国内享有较高的知名度。强有力的产地葡萄酒判别手段利于有效实施葡萄酒的原产地保护。在研究葡萄酒产地判别时，相较于葡萄酒中的其它有机类成分，选择矿质元素作判定指标具有一定的天然优势。葡萄酒中绝大部分矿质元素源自原料葡萄，而葡萄中元素主要吸收于种植地的土壤。通常来讲，土壤中矿质元素的种类和丰度具有地理地质特异性，因此在理论上，特定产地葡萄酒中的矿质元素应具有指纹特性，即携带着种植地土壤中具有地域特色的元素信息，从而区别于其它产地的葡萄酒。然而事实上，影响葡萄酒中矿质元素种类和含量的除原产地自然因素（土壤、气候、品种）外，栽培管理、环境污染及酿造工艺等人为因素也可能对酒中最原始的矿质元素产生不同程度的影响，如波尔多液或一些其它农药的使用会改变酒中Cu、Zn、Mn等元素的含量，不锈钢酿酒设备可能会影响Fe、Cr、Ni等的含量，葡萄酒澄清时所用的膨润土可能会影响Al、Na、Ca及部分稀土元素。所以，在应用矿质元素来识别产地葡萄酒时，还需借助化学计量学的方法严格甄选特征矿质元素，即尽可能多地选择那些只取决于产地因素而不受人为因素明显影响的元素。基于上述原因，本试验选取Bi、Ce、Cs、Eu、Ga、La、Li、Mg、Rb、Sb、Sm、Sr、Tl、U及Zr等15种矿质元素作初步判定指标，多重比较后发现这些元素在不同原产地葡萄酒中的分布有其各自的特征，如贺兰山东麓和沙城葡萄酒中的Li和Mg含量远高于通化和云南红，而Zr、La及Tl等的含量远低于通化和云南红，这也就说明应用所选元素来表征不同地域间的差异是有效的。主成分分析和判别分析结果从不同角度证实了利用所测矿质元素对不同原产地葡萄酒的产地判别是可行的。逐步判别分析筛选出Zr、Li、Sr、Cs及Mg等5种对产地区分有效的元素指标，对4个不同原产地葡萄酒的整体正确判别率达95%以上。在所选的5个元素指标中，Li和Cs为碱金属，Sr和Mg为碱土金属，说明这两类元素可能是葡萄酒产地区分的关键元素，类似结果在德国、西班牙、罗马尼亚等国的原产地葡萄酒鉴别研究中也有发现。
4 结论
Bi、Ce、Cs、Eu、Ga、La、Li、Mg、Rb、Sb、Sm、Sr、Tl、U及Zr等15种矿质元素在贺兰山东麓、沙城、通化及云南红等4个原产地葡萄酒的80个样品中均有检出，多重比较分析表明不同原产地葡萄酒中的矿质元素分布各具特征。主成分分析表明不同原产地葡萄酒的区域分布与相关元素含量差异性基本一致。逐步判别分析筛选出Zr、Li、Sr、Cs及Mg等5个对产地判别作用明显的元素指标，它们对不同原产地葡萄酒的回代和交叉检验的整体正确判别率分别为98.8%和96.3%。上述结果初步表明矿质元素指纹分析对国内原产地葡萄酒的产地判别是可行有效的。

附件：

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