主题：【第十届原创】钛盐比色（TSS）法——一种新的抗氧化能力检测方法

钛盐比色（TSS）法——一种新的抗氧化能力检测方法
过氧化氢（H₂O₂）是一种非自由基形态的ROS，生物机体中的H₂O₂主要产生于胞内的过氧化物酶体，包括葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶等在内的多种氧化酶在催化氧化还原反应的过程中均会伴随H₂O₂的形成（Valko et al. 2007）。另外，SOD催化O₂^•-的歧化分解也产生H₂O₂。较其它生物类自由基，H₂O₂活性（氧化还原能力）较弱但膜穿透能力较强，在正常生理pH和温度环境下，尤其是无过渡金属离子存在时，H₂O₂通常被过氧化氢酶转化为O₂和H₂O。然而，H₂O₂一旦产生过量，即可跨膜抵达胞内其它部位进而攻击多种生物大分子，如H₂O₂可降解血红蛋白并释放出Fe²⁺（Karadag et al. 2009），后者又催化H₂O₂通过芬顿反应产生细胞毒性极强的^•OH。
目前研究中用于测定物质清除H₂O₂能力的方法主要分为三类：基于紫外分光技术的直接清除法、基于荧光的高香草醛法和冬莨菪素法以及基于化学发光的芳基草酸酯法和鲁米诺法，其中荧光法和化学发光法因仪器普及度不高和所用试剂昂贵而较少使用，应用较多的即为直接清除法（Direct scavenging, DS）。DS法依据H₂O₂在紫外区有特征吸收且强度与其浓度成正比的原理而建立，当反应体系中存在H₂O₂清除剂时230~240 nm处的特征吸收随之减弱（Ruch et al. 1989）。然而在DS法实际应用中，由于绝大部分物质在≤ 240 nm这一紫外区段都存在强烈的本底吸收而干扰读数，易致测试不能正常进行，尤其是对于植物提取物之类的复杂混合物样品（Amous et al. 2002;Karadag et al. 2009）。本研究在采用DS法测试VPE清除H₂O₂能力时就遇到类似问题，因此有必要重新建立一种切实有效的测试复杂混合物清除H₂O₂能力的方法。
H₂O₂在酸性条件下与钛离子（Ti⁴⁺）可形成稳定的显色络合物，颜色深浅与H₂O₂或Ti⁴⁺量成比例，目前依据上述原理并利用TiOSO₄、Ti(SO₄)₂、K₂TiO(C₂O₄)₂、TiCl₄等钛盐定量H₂O₂或H₂O₂定量钛的研究多集中在植物生理学、冶金、印染等领域（Patterson et al. 1984; 段颖等2001; 张瑛洁等2008）。本文在DS法的基础上结合Ti(IV)-H₂O₂显色原理，以VPE为测试对象，以期建立一种新的测定清除H₂O₂能力的抗氧化评价方法。另外，对多种抗氧化测试手段的方法学特征进行综合考量，以期优选出一套系统研究冬剪枝条抗氧化的方法体系。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1..2 主要试剂
甲醇（MeOH）、丙酮（Me₂CO）、硫酸（H₂SO₄）等分析纯化学试剂购自西安化学试剂厂；过氧化氢（H₂O₂）、四氯化钛（TiCl₄）及硫酸钛（Ti(SO₄)₂）等购自国药集团；维生素C（Vc）、没食子酸（GA）、水溶性维生素E（Trolox）等购自Sigma-Aldrich上海贸易有限公司。
1.2 研究方法
1.2.1 钛盐比色法（Titantnium saltsspectrophotometry, TSS）
TSS测试分为两步，第一步为清除反应，反应体系包括一定量（1 mL）不同浓度样品（标准物质或VPE）、H₂O₂（0.5 mL, 10 mM）及PBS（1.5 mL, 60 mM pH 7.4），混匀于37°C水浴中准确温育30 min；第二步为显色反应，向温育后的反应体系中加入Ti(SO₄)₂溶液（0.1 mL, 50 mM），振荡后会产生少量黄色沉淀，随后再加H₂SO₄（2.0 mL, 1.2 M），待沉淀完全溶解即可测404 nm下Abs，反应体系终体积为5.1 mL。同体积H₂O替换H₂O₂作空白或80% MeOH替换样品作对照。
TSS法所测抗氧化能力，即H₂O₂清除率按公式3-1计算，结果以EC₅₀（半清除浓度）、TEE（与单位质量VPE等效的Trolox量）及TES（与单位质量植物材料等效的Trolox量）表示。
1.2.2 直接清除法（Direct scavenging, DS）
DS测试步骤同TSS法中的第一步反应，温育后的反应体系直接在240 nm下测Abs。同体积H₂O替换H₂O₂作空白或80% MeOH替换样品作对照。
DS法结果计算与表示同TSS法。
1.2.3 冬剪枝条中抗氧化物质的提取
同3.1.2.1
1.3 数据处理
以上指标至少重复测定3次，结果以均值（± S.D.）表示，实验数据采用Microsoft Office 2003和SPSS Statistics 17.0进行分析，差异显著水平为P < 0.05或0.01。
2 结果与讨论
2.1 TSS法测试抗氧化的可行性及测试参数的确定
一方面，四价钛盐如Ti(SO₄)₂定量H₂O₂的基本化学原理是两者反应可形成稳定络合物过钛酸（H₂[TiO₂(SO₄)₂]），过钛酸易溶于酸性介质而在碱性条件下则以沉淀形式存在。另一方面，为了评价供试样品在近生理条件下清除H₂O₂的能力，我们选择pH值为7.4的弱碱性反应环境，这就意味着清除反应之后的显色过程会产生（部分）沉淀，在固定pH条件下沉淀量与体系中的H₂O₂或Ti (SO₄)₂量有关，加入一定量足以中和碱性体系并完全溶解沉淀的H₂SO₄后，即可得到澄清的橘黄色比色液，其中显色物质为过钛酸根水合离子（[Ti(O₂)OH]⁺）。
2.1.1 不同钛盐的选择及最佳检测波长确定
对溶解沉淀后的反应体系进行200~600 nm波段扫描，光谱图提示反应液在404 nm处有一强特征吸收（图4-1A），峰形对称，无干扰，因此选择404 nm为TSS法的检测波长。不同钛盐对应的吸收峰不同，使用TiCl₄时的最大吸收峰在417 nm附近，虽然峰值较Ti(SO₄)₂大，但因为TiCl₄溶液配制过程较危险，故未选择。

2.1.2 硫酸使用量的确定
固定H₂O₂（0.5 mL, 10 mM）及Ti (SO₄)₂（0.1 mL, 50 mM）用量，并以对照管为对象测试不同浓度H₂SO₄对Abs的影响，图4-1B显示Abs随着硫酸浓度增加而升高，表明沉淀在逐步溶解，当H₂SO₄浓度为1.2 M时Abs达最高值，浓度超过1.6 M时Abs呈下降趋势，因此TSS法H₂SO₄的最佳使用浓度为1.2 M（添加体积为2.0 mL）。
2.1.3 硫酸钛使用量的确定
Ti(IV)与H₂O₂互为显色剂，一者用量固定时需考察另一者的最佳剂量。因高浓度Ti (SO₄)₂溶液呈紫色且易水解，经多次筛选最终选择1.2% Ti(SO₄)₂（w/v, 无色溶液）进行剂量测试。在固定H₂O₂（0.5 mL, 10 mM）及H₂SO₄（2.0 mL, 1.2 M）条件下，考察了不同剂量Ti(SO₄)₂（0.24~2.16mg）在404 nm下的显色效果。图4-1C表明Abs值随Ti(SO₄)₂剂量增加呈明显线性升高趋势，Ti(SO₄)₂为1.20 mg时Abs达最高值，此后剂量再增加而Abs无明显变化，故TSS法中Ti(SO₄)₂的最佳使用量为1.20 mg。

H2O2 + Ti(SO4)2 → H2[TiO2(SO4)2]  or [Ti(O2)OH]+

4-1

本研究中Ti(SO₄)₂用量为1.20 mg时，其与对应H₂O₂的摩尔质量比约为1，因此我们推测在TSS反应体系中Ti(SO₄)₂与H₂O₂间的反应可能按等摩尔进行（式4-1）。随后对此进行多次验证：分别固定Ti(SO₄)₂或H₂O₂用量，并考察Abs值最大时H₂O₂或Ti(SO₄)₂用量，进而计算得出两者间反应的摩尔质量比范围为0.915~1.172，平均约1.020（表4-1）。

表4-1 钛盐体系中硫酸钛与过氧化氢之间反应的化学计量关系

Table 4-1Stoichiometric relationship between H₂O₂ and Ti(SO₄)₂ in TSS reaction system

固定Ti4+   用量   Constant Ti4+   dosage (mg)	吸光值最大时   所需H2O2量   H2O2 dosage at the   maximal Abs (mg)	Ti4+/H2O2   摩尔比   Molar ratio	固定H2O2   用量   Constant H2O2   dosage (mg)	吸光值最大时   所需Ti4+量   Ti4+ dosage at the   maximal Abs (mg)	Ti4+/H2O2   摩尔比   Molar ratio
0.24	0.035	0.960	0.017	0.118	0.987
0.48	0.069	0.986	0.034	0.239	0.995
0.72	0.100	1.020	0.068	0.516	1.076
0.96	0.116	1.172	0.102	0.758	1.053
1.2	0.160	1.063	0.136	0.907	0.945
1.44	0.193	1.057	0.17	1.172	0.977
1.68	0.260	0.915	0.204	1.584	1.100
1.92	0.280	0.971	0.238	1.739	1.035

注: H₂O₂分子量: 34;Ti(SO₄)₂分子量: 240
Note: H₂O₂molecule weight: 34; Ti(SO₄)₂ molecule weight: 240
2.1.4 显色体系的稳定性
测定反应体系在不同时间的Abs显示：显色络合物在7 h内有良好的稳定性（图4-1D），随后吸光值开始缓慢下降。
2.2 TSS测试的方法验证
2.2.1 线性关系考察
取不同剂量H₂O₂（0.0085~0.17mg/5.1 mL）按照4.2.1确立的TSS条件建立标准曲线（图4-2），H₂O₂浓度在1.7~33.3 mg/L范围内与Abs符合朗伯比尔定律（表4-2），线性关系良好，相关系数R² = 0.9924，反应产物的摩尔吸光系数约1030.6 L/M cm。
DS法中H₂O₂浓度与Abs在68.2~340.3mg/L范围内也有良好的线性关系，相关系数R² = 0.9997，摩尔吸光系数约43.8 L/M cm。


2.2.2 检测灵敏度考察
最低检出限（Limit of detection, LOD）和定量限（Limit of quantification, LOQ）是评价分析方法灵敏度的两个重要指标，数值越低表明灵敏度愈高。国际纯粹和应用化学联合会（IUPAC）规定：LOD = k • s_b/S（式中k代表依据一定置信水平确定的系数，通常k = 3；s_b为空白多次测定结果的标差；S为标准曲线的斜率），当k = 10时的计算结果为LOQ。本研究中，TSS法的LOD和LOQ分别为0.11和0.35 mg/L（表4-2），灵敏度较DS法提高了近23倍。

表4-2 钛盐比色法和直接清除法方法学验证及比较

Table 4-2Comparasion of methodological validation characteristics between TSS and DS

方法   Method	标准曲线   Calibra. curves	线性系数   Linear   coefficient	范围   Range   (mg/L)	摩尔吸光系数   Molar absorp.   (L/M cm)	检出限   LOD   (mg/L)	定量限   LOQ   (mg/L)	精密度   Precision   (%)	准确度   Accuracy   (%)
TSS	y =  5.573x +   0.0175	R2 = 0.9924	1.7~33.3	ε = 1030.6	0.11	0.35	0.58~2.17a	85.2~94.2a
							0.98~3.36b	84.3~96.1b
DS	y =  0.4387x -   0.0039	R2 = 0.9997	68.2~340.3	ε = 43.8	2.53	8.33	2.85~7.15a	76.3~86.8a
							4.33~8.25b	68.2~77.5b

注: 上标^a代表Trolox (n = 5); ^b代表赤霞珠冬剪枝条提取物 (n = 5).
Note: ^astands for Trolox; ^b stands for VPE of Cabernet Sauvignon.
2.2.3 精密度考察
配制浓度分别为0.1、0.2、0.3 mg/mL的Trolox和VPE溶液，按照4.2.1确立的测试条件测定其清除率，每个浓度连续测试至少5次，并计算其相对标准偏差（RSD, %），TSS法中不同浓度Trolox和VPE的RSD范围分别为0.58~2.17%和0.98~3.36%，均小于5%，也低于DS法中对应的2.85~7.15%和4.33~8.25%（表4-2），说明TSS法的测试精密度和结果重复性优于DS法。
2.2.4准确度考察
向浓度为0.2 mg/mL的Trolox和VPE溶液中分别添加不同剂量（0.01、0.05、0.1 mg）H₂O₂，按4.2.1的测试条件每个样平行测定5次，回收率结果见表4-2。TSS法测试条件下Trolox和VPE的回收率范围分别为85.2~94.2%和84.3~96.1%，高于DS法中对应的回收率，说明TSS法的测试准确度高于DS法。
2.3 TSS法测试葡萄冬剪枝条和标准物质清除H₂O₂能力
在TSS测试中，反应动力学特征显示Abs随反应时间延长而降低，表明体系中的H₂O₂含量正在逐步减少，30 min左右Abs趋稳（图4-3A），说明清除过程接近完成，较对照（Control），VPE和Trolox表现出明显的H₂O₂清除能力；对照Abs在测试过程中一直存在缓慢下降的趋势，可能是偏碱性（pH 7.4）的反应介质导致H₂O₂少量分解造成的。进一步研究发现VPE对H₂O₂的清除呈良好量效关系（图4-3B），浓度为400 μg/mL时，图中所有VPE均达最高清除值。另外，阳性对照Trolox同浓度下的清除力低于VPE。


TSS法测试结果以EC₅₀、TEE及TES表示（表4-3），10个供试VPE中清除H₂O₂能力最强的为VT（EC₅₀值最小而TEE最大），最弱为HMG（EC₅₀值最大而TEE最小），平均EC₅₀值约149.61 ± 65.45 μg/mL，显著高于Trolox（343.21 ± 5.02 μg/mL）（P < 0.01）。单位质量冬剪枝条清除力最强的为VT，最弱的为PN，平均TES约1.52 ± 0.70 mM/g samp。所有品种清除力顺序为：VT >TSL ≥ CS > CF > KY ≥ ML > RG > CH ≥ HMG ≥ PN，除TSL与CS间、CH、HMG、PN互相间外，其余品种间皆存在显著差异（P < 0.05）。标准物质中清除力最强的为Catechin，略高于VPE中的VT；其次为TBHQ，清除力仅高于CH、HMG及PN；Vc和Trolox清除力相当。

表4-3 钛盐比色法和直接清除法测定冬剪枝条和标准物质清除过氧化氢能力

Table 4-3 H₂O₂ scavenging capacities of vine prunings andstandards estimated by TSS and DS assays

样品   Sample		TSS-H2O2			DS-H2O2
		EC-50   (μg/mL)	TEE   (mM/g extr)	TES   (mM/g samp)	EC-50   (μg/mL)	TEE   (mM/g extr)	TES   (mM/g samp)
VPE	CF	116.43 ± 3.49 c	11.39 ± 0.34 e	1.61 ± 0.05 d	N/A	N/A	N/A
	CH	183.65 ± 3.67 f	7.22 ± 0.14 b	0.81 ± 0.02 a	148.65 ± 7.98	8.32 ± 1.59	1.42 ± 0.11
	CS	100.42 ± 2.01 b	13.20 ± 0.26 f	2.09 ± 0.04 e	90.22 ± 10.23	14.65 ± 1.16	2.09 ± 0.17
	HMG	269.56 ± 4.20 h	4.92 ± 0.11 a	0.79 ± 0.02 a	88.76 ± 8.47	14.94 ± 0.65	2.39 ± 0.11
	KY	119.66 ± 2.39 c	11.07 ± 0.22 e	1.41 ± 0.03 c	N/A	N/A	N/A
	ML	140.53 ± 2.81 d	9.43 ± 0.19 d	1.40 ± 0.03 c	N/A	N/A	N/A
	PN	253.75 ± 4.07 g	5.22 ± 0.10 a	0.76 ± 0.02 a	130.54 ± 9.87	11.04 ± 0.90	1.61 ± 0.08
	RG	153.82 ± 4.61 e	8.62 ± 0.26 c	1.19 ± 0.04 b	N/A	N/A	N/A
	TSL	94.63 ± 2.37 b	14.01 ± 0.35 g	2.10 ± 0.05 e	N/A	N/A	N/A
	VT	63.64 ± 0.64 a	20.82 ± 0.21 h	3.05 ± 0.03 f	126.54 ± 9.87	11.04 ± 0.90	1.61 ± 0.08
标准   物质   Stand.	Trolox	343.21 ± 5.02 i			321.21 ± 9.32
	Vc	345.35 ± 3.23 i			322.14 ± 7.65
	TBHQ	180.32 ± 1.43 f			124.48 ± 6.32
	Catechin	61.93 ± 0.83 a			78.36 ± 8.84
VPE均值Avg.		149.61 ± 65.45**	10.59 ± 4.57	1.52 ± 0.70	N/A	N/A	N/A

注: TEE或TES: 表示与单位干重VPE或植物材料等效的Trolox量; 同列内数值后相同字母表示差异不显著; 上标^**表示所有VPE的EC₅₀均值与Trolox间存在显著差异; N/A: 不可用.
Note:TEE or TES: the amounts of Trolox having equivalent effects to unit mass ofextracts or botanical samples on dryweight; Values with same letters in each column are not significantly differentat P < 0.05; ‘**’ indicatessignificant difference of the mean EC₅₀ between all VPE and Troloxat P < 0.01; N/A: Not Available.
对比TSS法，DS法在测试VPE过程中仅能对部分样品的H₂O₂清除能力做出评价，但测定结果的重复性较差，其余样品因背景干扰过大且难以消除而致无法正常测试。当对VPE进行稀释时我们发现：稀释倍数较小时不足以消除干扰吸收，较大时VPE则丧失了清除能力。另外，在DS测试中，当VPE与H₂O₂反应后，样品本底可能已经发生改变，尤其是对于紫外区波段下的吸收，这种情况下即便设置样品空白也可能是无效的。在对标准物质的测试中，就EC₅₀值而言，DS法虽在数值上低于TSS法，但两者所测不同物质间清除能力的差异趋势相同，同时，DS法依旧存在测定重复性差的问题，这主要是因为方法自身精密度较差（详见2.2.3精密度考察）。
2.4 TSS法与其它抗氧化测定方法的相关性
相关性研究结果显示：在针对VPE的抗氧化能力测试中，TSS法与清除O₂^•-的PMS/NADH法、清除^•OH的TBA法及清除ONOO^-的EB法之间呈极显著正相关（P < 0.01），与测定螯合力的Ferrozine法显著正相关（P < 0.05），而与清除人工自由基的ABTS法、清除¹O₂的RNO法、清除ROO^•的Crocin/ABAP法、测定还原力的CUPRAC法及抗脂质过氧化的TBARS法间呈弱相关无相关性。

表4-4 钛盐比色法与其它抗氧化方法之间的相关性

Fig. 4-4Correlations between TSS and other antioxidative methods

	TSS	ABTS	PMS/N.	TBA	Crocin/A.	RNO	EB	TNB	TBARS	Ferrozine	CUPRAC
TSS	1	0.195	0.809**	0.925**	-0.001	0.212	0.787**	0.018	0.189	0.405*	0.277

注: 上标**表示在0.01水平显著(双尾); 上标*表示在0.05水平显著(双尾).
Note:‘**’ indicate the significant correlation at the 0.01 level (two-tail); ‘*’indicates the significant correlation at the 0.05 level (two-tail).
2.5 不同抗氧化测试的方法学比较
由于物质抗氧化作用的多重性特点，目前已建立的抗氧化方法虽达几十种之多，但尚无一种可全面评价物质的抗氧化特性，每种方法具体特征不一且仅能反映抗氧化作用的某一方面，因此在对给定测试物的抗氧化研究中，须结合实际情况同时采用多种不同方法尽可能给出全面评价。在方法的具体选择中，既要优先考虑使用具有生物相关性或近生理条件的方法，又要避免类似机理方法的重复但不失测试全面性，同时尽可能兼顾效率和成本。遵循上述原则，对本研究中的19种不同抗氧化测试进行了综合比较，结果见表4-5。
在清除人工自由基测试中，DPPH和ABTS是两种同时基于电子转移（ET）和氢原子转移（HAT）的非竞争性机制方法，虽不具生物相关性，但因测试便捷、准确度高等特点，目前仍是应用最广泛的两种抗氧化评价方法，尤其适合大量样品初筛。两种方法在本研究中呈极显著的正相关关系，但因ABTS测试可在近生理pH下进行，且较DPPH法省时，因此在后续研究中若需进行人工自由基清除测试，则推荐使用ABTS法。
在清除O₂^•-中，PMS/NADH和VB₂/Met均为基于ET的竞争性机制方法，两者在VPE测试中呈极显著相关。PMS/NADH法虽然成本较高，但因其自由基产生过程为易控制的化学反应，较VB₂/Met的光激发更准确迅速、结果重复性也越高，同时测试环境更近pH，因此推荐PMS/NADH。
在清除^•OH中，首先需说明的是外源抗氧化剂清除机体内^•OH的可能性很小，主要因为^•OH存在时间极短，一旦产生遂即攻击胞内的生物分子。尽管体外清除^•OH测试现实意义不大，但仍为广大研究者使用。本研究中TBA和Phen均为竞争性机制方法，但两种测试所用靶分子不同，前者为生物大分子脱氧核糖，后者为邻二氮菲-亚铁，因此TBA法的生物相关性更高，故推荐之。

表4-5 19种抗氧化方法的综合比较

Table 4-5Comprehensive comparations of methodological aspects among 19 antioxidativeassays

方法   Method	动力学   Kinetics	pH值   pH value	生物相关性   Biolo. rele.	可能机理Possi. mech.	反应时间   Time (min /one samp.)	费用   Cost (CNY /100 samp.)	难度   Diffi.   level	综合推荐   Recom.   level
DPPH	NC	‘N/A’	-	ET, HAT	40	30	※	☆
ABTS	NC	7.0	-	ET, HAT	25	35	※※	☆☆
PMS/NA.	C	7.4	++	ET	5	170	※	☆☆☆
VB2/Met	C	7.8	+	ET	16	50	※	☆
TBA	C	7.4	+++	EA, HAT	75	95	※※	☆☆☆
Phen	C	7.4	+	EA	60	10	※	☆☆
TSS	NC	7.4	+	EA	35	10	※	☆☆
CRT/LA	C	7.0	+++	HAT	180	720	※※	☆☆
Crocin/AB.	C	7.4	+++	HAT	50	35	※	☆☆☆
RNO	C	7.0	+++	PQ	40	10	※	☆☆☆
TNB	C	7.4	++	ET	15	5	※※	☆☆☆
SNP	C	7.4	++	ET, NT	190	40	※	☆☆
EB	C	7.4	++	NT	30	20	※※※	☆☆☆
TBARS	C	7.4	+++	HAT	115	670	※※	☆☆☆
FTC	C	7.4	+++	HAT	10085	1450	※※	☆☆
Ferrozine	NC	6.8	+	CO	5	35	※	☆☆
PB	NC	6.6	-	ET	30	205	※	☆
FRAP	NC	3.6	-	ET	30	100	※	☆
CUPRAC	NC	7.0	+	ET	20	50	※	☆☆

注: C: 竞争性机制; NC: 非竞争性机制; EA: 亲电加成; ET: 电子转移; HAT: 氢原子转移; PQ: 物理猝灭; NT: 硝基化; CO: 配位; ‘-、+、++、+++’：无、低、中、高生物相关性; ‘※、※※、※※※’: 低、中、高操作难度; ‘☆、☆☆、☆☆☆’: 低、中、高推荐程度; N/A: 不可用.
Note: C:competitive; NC: non-competitive; EA: electrophilic addition; ET: electrontransfer; HAT: hydrogen atom transfer; PQ: physical quenching; NT: nitration;CO: coordination; ‘-、+、++、+++’:non-、low-、medium-、high-relevance;‘※、※※、※※※’: low-、medium-、high-operationdifficulty; ‘☆、☆☆、☆☆☆’: low-、medium-、high-recommendation;N/A: Not Available.
对于清除H₂O₂，传统的直接清除法因背景干扰难以消除，未能够准确评价全部被测VPE，新建TSS测试虽属于非竞争性机制反应，但却适用于VPE和众多其它抗氧化剂的测试，故作推荐。
对于清除ROO^•，CRT/LA和Crocin/ABAP在方法机制、生物相关性及反应机理等方面均相似，两者之间在本研究中也呈极显著正相关。但在具体反应过程中，两者靶分子敏感度不同，CRT/LA测试中除ROO^•之外的多种因素可致CRT漂白，而Crocin/ABAP法中Crocin只对ROO^•敏感且测试更为快速、经济，故而推荐后者。
RNO法是一种基于物理猝灭¹O₂的竞争性机制方法，具有生物相关性高、操作相对简单、费用低廉等特点，宜作推荐。清除HOCl的TNB法是一种基于ET的竞争性机制测试，生物相关性中等，但自由基获取非常方便，也宜作推荐。
在清除含氮活性氧NO^•和ONOO^-测试中，SNP法和EB法均属竞争性反应机制，生物相关性中等，反应机理前者以硝基加成（NT）和ET为主，后者主要为NT。本研究中中SNP与EB间存在极显著正相关性，但因生物机体内NO^•易转化活性更强的ONOO^-，故而应用EB法评价ONOO^-清除能力现实意义更大，故作推荐。
在抗脂质过氧化测试中，TBARS和FTC在反应机制、机理及生物相关性等方面均相似，两者之间也呈极显著的正相关关系，不同之处在于FTC法耗时长且费用高，因此在后续研究中推荐使用TBARS法。
螯合过渡金属离子作为物质抗氧化的重要机制之一，对于抑制自由基形成和脂质过氧化有着重要意义。Ferrozine法测定Fe²⁺螯合力方便、快速、准确，故作推荐。
还原力测试中，PB、FRAP及CUPRAC均为基于ET的非竞争性机制方法，三者之间相关度极高，不同的是PB和FRAP须在酸性条件下进行，且反应易受糖、有机酸等还原性物质干扰，而CUPRAC可在近生理的中性环境下进行，反应选择性较高（由于Cu²⁺氧化还原电位低于Fe²⁺），同时耗时少、费用低，故推荐之。
综上，为了尽可能全面分析葡萄冬剪枝条的抗氧化能力，我们推荐使用ABTS、PMS/NADH、TBA、TSS、Crocin/ABAP、RNO、TNB及EB等方法检测冬剪枝条清除人工自由基和多种活性氧的能力，使用TBARS法评价其抗脂质过氧的能力，使用Ferrozine法测试其螯合金属离子的能力，使用CUPRAC法衡量其还原特性。
3 小结
本文在DS法的基础上应用Ti(IV)-H₂O₂显色原理，建立了一种新的测定H₂O₂清除能力的抗氧化方法—钛盐比色（TSS）法。另结合第三章内容，对19种抗氧化测试的方法学特征进行了综合考量，小结如下：
（1）TSS法测试分为清除和显色两步，清除步骤的反应体系：适量VPE（1.0 mL, 0~400μg/mL）、H₂O₂（0.5 mL, 10 mM）及PBS（1.5 mL, 60 mM pH 7.4），反应温度37°C，反应时间30 min。显色步骤参数：Ti(SO₄)₂（0.1 mL, 50 mM）和H₂SO₄（2.0 mL, 1.2 M）。反应体系终体积5.1 mL。最佳检测波长404 nm。
（2）方法验证结果：线性范围1.7~33.3 mg/mL，摩尔吸光系数1030.6 L/M cm，检测限0.11 mg/L，定量限0.35 mg/L，精密度（RSD）0.58~3.36%，回收率84.3~96.1%。TSS法可成功用于评价VPE和多种标准物质的H₂O₂清除能力，且灵敏度高于DS法近23倍，同时精密度、重复性、准确度均优于DS法。
（3）所有VPE在测试浓度范围内均能有效清除H₂O₂，且量效关系明显，平均清除力约为标准物质Trolox和Vc的2.3倍，但低于Catechin和TBHQ。不同品种间的清除能力存在差异，最强和最弱的分别为VT和PN。
（4）相关性研究显示TSS法与PMS/NADH、TBA、EB及Ferrozine法之间存在极显著或显著正相关关系（P < 0.01或0.05），而与ABTS、RNO、Crocin/ABAP、CUPRAC及TBARS法间无相关性或呈弱相关。综合考量19种抗氧化测试的方法学特征，推荐使用ABTS、PMS/NADH、TBA、TSS、Crocin/ABAP、RNO、TNB、EB、TBARS、Ferrozine及CUPRAC等11种用于系统研究冬剪枝条的抗氧化特性。