主题：【求助】高效液相色谱基础问题

1、在使用高效液相色谱时，什么时候用梯度方法，什么时候用等梯度方法？
这个是根据方法或者样品出峰时间长短以及分离效果等决定的。
2、HPLC都有那些检测器可以用，是根据什么原理来选择的呢？
请参考高效液相色谱分析方法的建立这本书
3、液相色谱为什么要使用缓冲溶液，缓冲溶液中用很多需要加入少量的有机相的目的是什么，缓冲溶液的pH是如何选择的，对于同一个样品如果pH不同，对检测结果有什么样的影响呢？
因为缓冲液对PH值的变化具有较大的缓冲作用，故常用缓冲液控制流动相的pH值，其存在改变了化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用，调节其分配系数，此时流动相的缓冲盐浓度大，不利于样品的解离，使样品较快流出，因此会改善峰形，减小峰宽，抑制拖尾，塔板数自然提高。
－采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和 30mmol/L三乙胺溶液。
注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。
4、HPLC相对应的软件有几个，分别是什么？
这个看你们当前用的是什么系统了。
5、HPLC的进样量为5~100ul，那么进3ul会有什么影响，进样量太大会有什么影响呢？
进样量太小响应值太低不精确，太大出峰会拖尾或者柱子有残留（因情况不同）
6、为什么要用甲醇冲柱子，换成乙腈可以吗，如果不行，原因是？
7、为什么要用10：90的甲醇水冲洗柱子，换个比例可以吗，如果不行是因为什么呢？
这两个问题可以是一个问题，一般冲柱子大都是10%左右的甲醇或者乙腈，有的也可能浓度变高主要是对于缓冲盐来说的（怕柱子里边有缓冲盐析出）。至于流动相冲洗的选择也是以缓冲盐开说的，缓冲盐用10%甲醇然后用甲醇封柱子，其他的可以用10%乙腈或者乙腈来冲洗。

等度还是梯度是基于您的目标物质是否可以有效的分离，用什么样的检测器还是由你的样品目标物来确定。目前有紫外，荧光，示差，蒸发光散射等。进样量的多少也没有硬性的规定。如果灵敏度够，，进3ul当然也可以。乙腈易自聚，产生絮状物不宜冲柱子用吧。甲醇中加水冲柱子，可能是你的流动相里面含有缓冲盐，不然纯甲醇冲洗缓冲盐的效果不理想。欢迎拍砖

原文由 senke(lifen4607) 发表:1、在使用高效液相色谱时，什么时候用梯度方法，什么时候用等梯度方法？这个是根据方法或者样品出峰时间长短以及分离效果等决定的。2、HPLC都有那些检测器可以用，是根据什么原理来选择的呢？请参考高效液相色谱分析方法的建立这本书3、液相色谱为什么要使用缓冲溶液，缓冲溶液中用很多需要加入少量的有机相的目的是什么，缓冲溶液的pH是如何选择的，对于同一个样品如果pH不同，对检测结果有什么样的影响呢？因为缓冲液对PH值的变化具有较大的缓冲作用，故常用缓冲液控制流动相的pH值，其存在改变了化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用，调节其分配系数，此时流动相的缓冲盐浓度大，不利于样品的解离，使样品较快流出，因此会改善峰形，减小峰宽，抑制拖尾，塔板数自然提高。－采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和 30mmol/L三乙胺溶液。注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。4、HPLC相对应的软件有几个，分别是什么？这个看你们当前用的是什么系统了。5、HPLC的进样量为5~100ul，那么进3ul会有什么影响，进样量太大会有什么影响呢？进样量太小响应值太低不精确，太大出峰会拖尾或者柱子有残留（因情况不同）6、为什么要用甲醇冲柱子，换成乙腈可以吗，如果不行，原因是？7、为什么要用10：90的甲醇水冲洗柱子，换个比例可以吗，如果不行是因为什么呢？这两个问题可以是一个问题，一般冲柱子大都是10%左右的甲醇或者乙腈，有的也可能浓度变高主要是对于缓冲盐来说的（怕柱子里边有缓冲盐析出）。至于流动相冲洗的选择也是以缓冲盐开说的，缓冲盐用10%甲醇然后用甲醇封柱子，其他的可以用10%乙腈或者乙腈来冲洗。

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有机相与水相等比例时，流动相粘度最高，柱压会上升，对柱子不利。所以，在应用时应尽量避开这种比例。