磷脂广泛存在于种子、动物细胞膜等生物体中，在生命活动中扮演着重要的生物学作用。例如，心磷脂异常会造成线粒体功能障碍，进一步会产生心血管疾病[62]。开发新型的磷脂分离材料对于其高效分离纯化具有重要的意义，可为其结构和后续的生物学功能研究提供技术支持。本章进一步将所制备的Sil-NaUA和Sil-VDI色谱柱用于肺腺癌细胞和鸡蛋黄磷脂提取物的分析，通过结合蒸发光散射检测，初步探索了所发展的色谱柱对磷脂样品的分离分析效果。

试剂和仪器	公司名称
P230II高效液相色谱系统	大连依利特分析仪器有限公司
ELSD6000蒸发光散射检测器	美国奥泰科技有限公司
RE52CS旋转蒸发器	上海亚荣生化仪器厂
氯仿、丙酮	天津市大茂化学试剂厂
色谱甲醇、乙腈	上海星可高纯溶剂有限公司
无水乙醇	天津市汇杭化工试剂有限公司
色谱用纯水	法国Millipore公司的Milli-Q系统纯化
色谱异丙醇（IPA）	天津市科密欧化学试剂有限公司

磷脂样品的制备

肺腺癌细胞磷脂的提取按照传统的Folch法[63]，肺腺癌细胞经裂解后，按照1:18（w/v）的比例加入混合溶剂氯仿-甲醇（2:1，v/v）。充分摇匀后，于3000 r/min离心10 min，继续加入0.2倍体积的水，摇匀后，以3000 r/min离心10 min得到分层的上下两层液体。将上清液移除，用甲醇-水（1:1，v/v）冲洗两个界面之间，得到下层膜脂的溶液。将下层溶液用氮气吹干，得到细胞磷脂样品，备用。

鸡蛋黄磷脂的提取方法[64]：取新鲜鸡蛋一枚，将其蛋黄部分分离置于烧杯中，按其重量1:10加入95%的乙醇，混合均匀后，移至圆底烧瓶中，常温下磁力搅拌2 h，抽滤，得到乙醇混悬液。重复加入95%的乙醇洗涤残渣2-3次，抽滤，合并混悬液。将混悬液置于旋转蒸发仪中减压浓缩，得到浓缩物，加入丙酮反复洗涤，直至丙酮洗涤液接近无色，然后将浓缩物用氮气吹干，得到蛋黄磷脂样品，备用。

色谱分离条件

磷脂样品分离采用甲醇/乙腈/水或甲醇/乙腈/异丙醇为流动相，流速为1.0 mL/min，等度洗脱，蒸发光散射检测器漂移管温度为100℃，雾化气压力350 kPa，载气流速为2.0 L/min。

结果与讨论

首先采用肺腺癌细胞磷脂提取物为样品，结合蒸发光散射检测，初步探索了Sil-VDI和Sil-NaUA色谱柱对磷脂样品的分离效果。如图4-1a和4-1b所示，以甲醇/乙腈/水（65:17.5:17.5，v/v/v）为流动相，Sil-VDI色谱柱能够在8 min以内分离出6个主要色谱峰；在相同的流动相条件下，Sil-NaUA色谱柱在8 min以内只能分离出1个色谱峰。基于此，我们进一步优化了流动相的组成和比例，如图所示，以甲醇/乙腈/异丙醇（60:20:20，v/v/v）为流动相，Sil-NaUA色谱柱可分离出2个色谱峰。显然，对于肺腺癌细胞磷脂提取样品，Sil-VDI色谱柱的分离效果明显优于Sil-NaUA色谱柱的效果。

肺腺癌细胞磷脂样品在Sil-VDI（a）和Sil-NaUA（b，c）色谱柱中的分离谱图

实验条件：（a，b）流动相，甲醇/乙腈/水（65:17.5:17.5，v/v/v）；（c）流动相，甲醇/乙腈/异丙醇（60:20:20，

v/v/v）；流速，1.0 mL/min

Fig. 4-1 Separation chromatograms of lung adenocarcinoma cell phospholipids on Sil-VDI (a) and

Sil-NaUA (b, c) columns

Experimental conditions: eluent, CH3OH/ACN/H2O (65:17.5:17.5, v/v/v) for (a, b), CH3OH/ACN/IPA (60:20:20, v/v/v) for (c); flow rate, 1.0 mL/min

我们进一步将Sil-VDI和Sil-NaUA色谱柱用于了鸡蛋黄磷脂提取物的分析。对于鸡蛋黄磷脂样品，如图所示，以甲醇/乙腈/水(50:34:16，v/v/v)为流动相，在Sil-VDI色谱柱中同样可分离出6个主要色谱峰。在相同的条件下，Sil-NaUA色谱柱仅可分离出2个主要色谱峰。进一步优化洗脱条件，以甲醇/乙腈/异丙醇(40:40:20，v/v/v)为流动相，如图4-2c所示，Sil-NaUA色谱柱可进一步分离出3个主要色谱峰。显然，Sil-VDI色谱柱在分离鸡蛋黄磷脂提取物时同样展示了更高的分离选择性。