主题:【第十三届原创】Sil-NaUA和Sil-VDI色谱柱在磷脂分离中的应用

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Sil-NaUASil-VDI色谱柱在磷脂分离中的应用



磷脂广泛存在于种子、动物细胞膜等生物体中,在生命活动中扮演着重要的生物学作用。例如,心磷脂异常造成线粒体功能障碍,进一步产生心血管疾病[62]。开发新型的磷脂分离材料对于其高效分离纯化具有重要的意义,可为其结构和后续的生物学功能研究提供技术支持。本章进一步将所制备的Sil-NaUA和Sil-VDI色谱柱用于肺腺癌细胞和鸡蛋黄磷脂提取物的分析,通过结合蒸发光散射检测,初步探索了所发展的色谱柱对磷脂样品的分离分析效果。

试剂和仪器

公司名称

P230II高效液相色谱系统

大连依利特分析仪器有限公司

ELSD6000蒸发光散射检测器

美国奥泰科技有限公司

RE52CS旋转蒸发器

上海亚荣生化仪器厂

氯仿、丙酮

天津市大茂化学试剂厂

色谱甲醇、乙腈

上海星可高纯溶剂有限公司

无水乙醇

天津市汇杭化工试剂有限公司

色谱用纯水

法国Millipore公司的Milli-Q系统纯化

色谱异丙醇IPA

天津市科密欧化学试剂有限公司



磷脂样品的制备



肺腺癌细胞磷脂的提取按照传统的Folch[63]肺腺癌细胞经裂解后,按照1:18(w/v)的比例加入混合溶剂氯仿-甲醇(2:1,v/v)。充分摇匀后,于3000 r/min离心10 min,继续加入0.2倍体积的水,摇匀后,以3000 r/min离心10 min得到分层的上下两层液体。将上清液移除,用甲醇-水(1:1,v/v)冲洗两个界面之间,得到下层膜脂的溶液。将下层溶液用氮气吹干,得到细胞磷脂样品,备用。

鸡蛋黄磷脂的提取方法[64]:取新鲜鸡蛋一枚,将其蛋黄部分分离置于烧杯中,按其重量1:10加入95%的乙醇,混合均匀后,移至圆底烧瓶中,常温下磁力搅拌2 h,抽滤,得到乙醇混悬液。重复加入95%的乙醇洗涤残渣2-3次,抽滤,合并混悬液。将混悬液置于旋转蒸发仪中减压浓缩,得到浓缩物,加入丙酮反复洗涤,直至丙酮洗涤液接近无色,然后将浓缩物用氮气吹干,得到蛋黄磷脂样品,备用

色谱分离条件



磷脂样品分离采用甲醇/乙腈/水或甲醇/乙腈/异丙醇为流动相流速为1.0 mL/min,等度洗脱,蒸发光散射检测器漂移管温度为100,雾化气压力350 kPa,载气流速为2.0 L/min

结果与讨论



首先采用肺腺癌细胞磷脂提取物为样品,结合蒸发光散射检测,初步探索了Sil-VDI和Sil-NaUA色谱柱对磷脂样品的分离效果如图4-1a和4-1b所示,以甲醇/乙腈/水(65:17.5:17.5,v/v/v)为流动相,Sil-VDI色谱柱能够在8 min以内分离出6个主要色谱峰;在相同的流动相条件下,Sil-NaUA色谱柱在8 min以内只能分离出1个色谱峰。基于此,我们进一步优化了流动相的组成和比例,如图所示,以甲醇/乙腈/异丙醇(60:20:20,v/v/v)为流动相,Sil-NaUA色谱柱可分离出2个色谱峰。显然,对于肺腺癌细胞磷脂提取样品,Sil-VDI色谱柱的分离效果明显优于Sil-NaUA色谱柱的效果。



  肺腺癌细胞磷脂样品在Sil-VDIa)和Sil-NaUAbc)色谱柱中的分离谱图

实验条件:ab流动相,甲醇/乙腈/水(65:17.5:17.5v/v/v);c流动相,甲醇/乙腈/异丙醇(60:20:20

v/v/v;流速,1.0 mL/min

Fig. 4-1  Separation chromatograms of lung adenocarcinoma cell phospholipids on Sil-VDI (a) and

Sil-NaUA (b, c) columns

Experimental conditions: eluent, CH3OH/ACN/H2O (65:17.5:17.5, v/v/v) for (a, b), CH3OH/ACN/IPA (60:20:20, v/v/v) for (c); flow rate, 1.0 mL/min



我们进一步将Sil-VDI和Sil-NaUA色谱柱用于了鸡蛋黄磷脂提取物的分析。对于鸡蛋黄磷脂样品,如图所示,以甲醇/乙腈/水(50:34:16,v/v/v)为流动相,在Sil-VDI色谱柱中同样可分离出6个主要色谱峰。在相同的条件下,Sil-NaUA色谱柱仅可分离出2个主要色谱峰。进一步优化洗脱条件,以甲醇/乙腈/异丙醇(40:40:20,v/v/v)为流动相,如图4-2c所示,Sil-NaUA色谱柱可进一步分离出3个主要色谱峰。显然,Sil-VDI色谱柱在分离鸡蛋黄磷脂提取物时同样展示了更高的分离选择性。

鸡蛋黄磷脂样品在Sil-VDIa)和Sil-NaUAbc)色谱柱中的分离谱图

实验条件:ab流动相,甲醇/乙腈/50:34:16v/v/v),c流动相,甲醇/乙腈/异丙醇40:40:20

v/v/v);流速,1.0 mL/min

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