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液相色谱（LC）

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主题：【已应助】关于有关物质方法开发

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发表于：2021/08/29 20:08:28 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

新手，近期在做方法开发，我想向大家请教几个问题：

1.方法开发过程中供试品浓度如何确定？有人跟我说可以通过最低杂质的定量限然后推出供试品的大概浓度，这个要怎么计算

2.怎么样才能知道杂质的校正因子

3.做线性时，浓度应该做到多少，这个有具体的限制吗

4.关于方法开发中的一些开发步骤和知识有相关资料或书籍推荐吗

推荐答案：歪果仁zZ回复于2021/08/30

新手的问题并不新手。个人理解仅参考。
1.方法开发过程中供试品浓度如何确定？有人跟我说可以通过最低杂质的定量限然后推出供试品的大概浓度，这个要怎么计算
供试品不同行业概念不同，我理解的正规文章中写的供试品的制备，是指此供试品马上要制备成标曲了，因此供试品可能是标准品的储备液的意思。因此有人和你说的应该是对的，可以根据你的目标物中最低定量限来反推标曲最高浓度，再反推储备液的合适浓度。

2.怎么样才能知道杂质的校正因子
在进行药物的有关物质检查时，多采用高效液相色谱法，其计算方法有外标法、加校正因子的自身对照法、自身对照法及峰面积归一化法。其中加校正因子的自身对照法定量准确，又无需在每次检测时均提供杂质对照品，是目前较为常用的一种方法。
可以参考【杂质相对校正因子的测定——实战篇__搜狐网】https://2ly4hg.smartapps.cn/pages/article/article?articleId=124851338&authorId=484279&spm=smbd.content.share.0.1630293542802VoklF7O&_trans_=010005_wxhy_shw&_swebfr=1&hostname=bdlite
3.做线性时，浓度应该做到多少，这个有具体的限制吗
线性浓度应该是看你需要检测的目标物的浓度范围而定，没有具体限制，但线性范围一般大于100倍。
4.关于方法开发中的一些开发步骤和知识有相关资料或书籍推荐吗
多查查文献资料学习一下吧，都是从实践中来再到实践中去的。

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2021/8/30 11:00:08 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

做方法开发时，先参考相关标准或文献等，根据自己的仪器设备再确定或调整目标物出峰时间，浓度等。然后做方法检出限。

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歪果仁zZ

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2021/8/30 11:20:19 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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dahua1981

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2021/8/30 11:38:37 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1.方法开发过程中供试品浓度如何确定？有人跟我说可以通过最低杂质的定量限然后推出供试品的大概浓度，这个要怎么计算
一般情况下，LOQ是限度的1/5，至少也要保证到限度的1/2。因为有关物质肯定要控制在限度一下，如果限度才刚到定量限，那有关物质就不能定量检测了。
至于样品的浓度，个人认为只要主峰不过载，不出平头峰，就不算太高，甚至很多情况下，测定有关物质的主峰必须要过载。供试品的浓度也可以是定量限的2000-5000倍。
2.怎么样才能知道杂质的校正因子
校正因子的计算是根据线性斜率的比值进行计算的。校正因子和相对校正因子互为倒数。校正因子为线性试验项下主成分的线性方程的斜率/杂质的线性方程的斜率。校正因子为2说明，相同浓度下，杂质的响应值只是主成分响应值的二分之一。
3.做线性时，浓度应该做到多少，这个有具体的限制吗
这个没有具体数值限值，但是线性范围通常可参照相关国际标准或国家标准，一般满足如下要求：
a)采用校准曲线法定量，并至少具有6个校准点（包括空白），浓度范围尽可能覆盖一个或多个数量级，每个校准点至少以随机顺序重复测量2次，最好是3次或更多；对于筛选方法，线性回归方程的相关系数不低于0.98；对于准确定量方法，线性回归方程的相关系数不低于0.99；
b)校准用的标准点应尽可能均匀地分布在关注的浓度范围内并能覆盖该范围。在理想的情况下，不同浓度的校准溶液应当独立配制，低浓度的校准点不能通过稀释校准曲线中高浓度的校准点进行配制；
c)浓度范围一般应覆盖关注浓度的50%～150%，如需做空白时，则覆盖关注浓度的0～150%；
d)应充分考虑可能的基质效应，排除其对校准曲线的干扰。
4.关于方法开发中的一些开发步骤和知识有相关资料或书籍推荐吗
对此可参考文献：液相色谱实验步骤与方法开发

附件：

液相色谱实验步骤和方法开发.ppt

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2021/8/30 11:39:15 Last edit by dahua1981

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2021/9/1 16:48:44 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:1.方法开发过程中供试品浓度如何确定？有人跟我说可以通过最低杂质的定量限然后推出供试品的大概浓度，这个要怎么计算一般情况下，LOQ是限度的1/5，至少也要保证到限度的1/2。因为有关物质肯定要控制在限度一下，如果限度才刚到定量限，那有关物质就不能定量检测了。至于样品的浓度，个人认为只要主峰不过载，不出平头峰，就不算太高，甚至很多情况下，测定有关物质的主峰必须要过载。供试品的浓度也可以是定量限的2000-5000倍。2.怎么样才能知道杂质的校正因子校正因子的计算是根据线性斜率的比值进行计算的。校正因子和相对校正因子互为倒数。校正因子为线性试验项下主成分的线性方程的斜率/杂质的线性方程的斜率。校正因子为2说明，相同浓度下，杂质的响应值只是主成分响应值的二分之一。3.做线性时，浓度应该做到多少，这个有具体的限制吗这个没有具体数值限值，但是线性范围通常可参照相关国际标准或国家标准，一般满足如下要求：a)采用校准曲线法定量，并至少具有6个校准点（包括空白），浓度范围尽可能覆盖一个或多个数量级，每个校准点至少以随机顺序重复测量2次，最好是3次或更多；对于筛选方法，线性回归方程的相关系数不低于0.98；对于准确定量方法，线性回归方程的相关系数不低于0.99；b)校准用的标准点应尽可能均匀地分布在关注的浓度范围内并能覆盖该范围。在理想的情况下，不同浓度的校准溶液应当独立配制，低浓度的校准点不能通过稀释校准曲线中高浓度的校准点进行配制；c)浓度范围一般应覆盖关注浓度的50%～150%，如需做空白时，则覆盖关注浓度的0～150%；d)应充分考虑可能的基质效应，排除其对校准曲线的干扰。4.关于方法开发中的一些开发步骤和知识有相关资料或书籍推荐吗对此可参考文献：液相色谱实验步骤与方法开发

非常感谢您的回复，这些对我帮助非常大??

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