主题：【第十四届原创】笋瓜中氨基甲酸酯类农药残留分析方法测定小结

笋瓜中氨基甲酸酯类农药残留分析方法测定小结

    一、仪器设备与试剂、材料

    （一）仪器设备

    液相色谱仪(Agilent 1260高效液相色谱仪（二元泵），配荧光检测器（FLD），柱后衍生系统为美国科学系统公司的斯威特柱后衍生系统 双通道 PCR-2型、匀浆机、振荡器、氮吹仪及分析实验室常用设备。

    （二）试剂、材料：水为超纯水，乙腈、丙醇、甲醇均为色谱纯，氯化钠、柱后衍生试剂为pickering（包含邻苯二甲醛，OPA，巯基乙醇、OPA稀释剂和氢氧化钠溶液），农药标准品购自农业部环境保护科研监测所（100μg/mL）（见表1）。新鲜笋瓜样品、C18柱、SPE柱固相萃取小柱、0.2um滤膜。

表1：10种氨基甲酸酯类农药及其代谢物标准品

    二、实验方法

    （一）色谱条件

    预柱：C18预柱4.6mm×4.5cm；分析柱：ODS柱4.6×100mm；柱温：50℃；检测波长：激发波长330nm,发射波长465nm。溶剂梯度与流速见表2。

表2：溶剂梯度与流速

    柱后衍生：0.05mol/L氢氧化钠溶液，流速0.3mL/min，水解温度100℃；OPA试剂，流速0.3mL/min，衍生温度室温度。

    （二）样品提取、净化

    本次实验选用笋瓜样品不含有加标农药。准确称取25.0g试样, 加入50mL乙腈和10mL水,高速匀浆2min后用滤纸过滤。滤液收集到装有5g氯化钠的100mL具塞量筒中，剧烈震荡1min，静置30min,使乙腈相和水相分层。吸取10.00mL乙腈溶液于小烧杯中,80℃水浴锅上加热,氮吹近干。加入2.0mL甲醇+二氯甲烷(1+99)溶解残渣。用4.0mL甲醇+二氯甲烷(1+99)预淋洗氨基柱，将样品液倒入小柱内，用2.0mL甲醇+二氯甲烷(1+99)冲洗烧杯后淋洗小柱，并重复一次。50℃氮吹至2ml左右，甲醇定容至2.5mL，混匀，用0.2μm滤膜过滤后上机测定。

    三、结果分析

    （一）色谱条件选择

    多农药残留测定需要在同一次进样中有效地分离多种不同化学结构和极性的化合物,色谱条件的选择至关重要。本方法采用高效液相色谱ODS柱、柱槽温度为50℃的梯度淋洗流动相分离,在碱性溶液中氨基甲酸酯类农药分解出甲胺,甲胺与衍生化试剂反应生成一种强荧光物质,再用高灵敏的荧光检测器进行检测。结果表明,由于选择色谱柱比标准中建议短，所以在20min内, 10种氨基甲酸酯类农药已出完，但没有获得了满意的分离效果。降低流速和有机相比例后，获得了满意的分离效果和和极高的检测灵敏度。但是发现再下一个检测样品中发现有一些杂质吸收峰,因此又将梯度淋洗的流动相配比做了调整,即到20 min时,继续加长淋洗时间，做到充分清洗样品中尚未除掉的杂质,为下一次梯度淋洗检测提供良好的仪器检测状态。

    （二）标准溶液配制，绘制校准曲线

    10种氨基甲酸酯类农药标液用甲醇稀释至10.0ug/mL。分别准确吸取10种氨基甲酸酯类农药及其代谢物标液（10μg/mL）0.0μL、100μL、200μL、400μL、600μL（10μg/mL）至10 ml容量瓶内，用甲醇定容至10 ml，配制出浓度分别为0.0μg/mL 、0.005μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL六个浓度梯度的混合标准溶液，配制完成后上机测定峰面积和保留时间。以峰面积为纵坐标，以进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到直线方程。

    配制的混合标准工作溶液注入高效液相色谱仪进行测定，各农药分离度好，峰面积、峰高响应良好。以质量分数为横坐标、相应的峰面积为纵坐标，线性回归得10种氨基甲酸类农药的标准曲线方程、相关系数和检出限如表3所示，结果显示：10种氨基甲酸酯类农药相关系数可以达到0.995以上，线性关系非常好，符合《实验室质量控制规范  食品理化检测》(GB/T 27404-2008)标准要求。这就为从基质加标色谱图中和样品加标色谱中比较农药残留量提供了较好的依据。

    表3：10种氨基甲酸类农药残留的回归方程、相关系数和检出限

    （三）方法回收率

    采用上面所述分离、分析方法，10种氨基甲酸酯类农药分别添加0.2ug/mL、0.5ug/mL两个浓度进行回收率实验。每种添加浓度重复3个样本，每个样本重复测定3次。结果表明10种氨基甲酸酯类农药在20min内可以得到很好的分离,0.2至0.5ug/mL范围内线性良好，相关系数为1.0（除涕灭威为0.9965、涕灭威亚砜为0.9978外），检出限为0.001-0.006 mg/Kg；连续3次进样的保留时间、峰高、峰面积相对标准偏差比优化前均有降低。优化的检测方法，快速简便，灵敏度高，准确可靠，有效的提高了工作效率，能满足农产品中氨基甲酸酯类农药的液相检测要求。

    四、柱后衍生需要注意的问题

    简单说衍生就是将不能分析的样品通过衍生化试剂反应转化为可分析的化合物。氨基甲酸酯类农药的柱后衍生根据其原理，需要注意以下问题：

    1、选择合适的C18柱和 PSA小柱，可以更好去除色素杂质，富集待测农药残留量。

    2、了解衍生原理，水解试剂和衍生试剂不可以弄错，如果反了则无法衍生。

    3、反应试剂的流速、反应池的温度要稳定。

    4、盛放柱后衍生试剂的反应瓶应用甲醇彻底清洗，并用甲醇清洗浸在反应试剂中的管线。反应瓶用前用甲醇浸泡一周以上。

    5、水解试剂不建议自己配制，我试了几次很难得到足够纯度的NaoH。

    6、进样结束后继续加长淋洗时间，做到充分清洗样品中尚未除掉的杂质,为下一次梯度淋洗检测提供良好的仪器检测状态。