1、引言
20世纪60年代以来,人们逐渐发现多糖具有复杂多样的生物活性和功能,如多糖有免疫调节功能可作为广谱免疫促进剂,作为药物可以治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等;还具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂,促进核酸与蛋白质的生物合成等作用。菱,别名菱角、水菱角、风菱,为菱科菱属植物乌菱TrapabicomisOsbeck的种子,据文献记载,其果壳、果柄、果、茎及叶柄均可进药,有健胃止痢、抗癌等作用;还可用于治疗胃溃疡、痢疾、食道癌、子宫颈癌及乳腺癌等。
本研究首次从野生菱角壳中提取分离出多糖,并对多糖的单糖组成进行了深进的研究,为进一步开发和利用野生菱角资源提供了科学依据。
2、实验部分2.1 样品、试剂与仪器市售的菱角往仁后,壳晒干,粉碎备用。单糖及双糖标准物质(半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖和蜜二糖)均购自ChemService,纯度大于98%。所用化学试剂除甲醇和乙醇为色谱纯外,其余均为分析纯。UV-2501PC紫外光谱仪(日本岛津公司);NicoletMagna560傅里叶变换红外光谱仪(美国尼高力公司);VarianUnityPlus600核磁共振波谱仪(美国瓦里安公司);HP6890和HP5973
气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)。
2.2 实验方法
(1)多糖化合物的提取及纯化方法称取800g洗净晒干的菱角壳,加人1:1乙醇-乙醚混合液,65℃水浴回流1~3h往脂;残渣中加水,9O~100℃水浴提取4~6h,更换净水反复提取2~3次,合并深红色多糖提取液,过滤,浓缩。向提取液加人3/7倍体积的乙醇,离心分离沉淀,冻干得多糖粗品F1。向上清液中加人1.0倍体积的乙醇,离心分离沉淀,冻干得多糖粗品F2。依此方法,向上清液中先后加人1.5和4.0倍体积乙醇,分别得到多糖粗品F3和F4。。若直接向原多糖提取液中加人4倍体积的无水乙醇,则得到混合多糖粗品F5。用Sevag法除往多糖粗品中的蛋白质,H2O2法除往色素,透析72h后,浓缩,冻干,即得多糖纯品;
(2)多糖的水解取多糖样品10mg于安瓶中加人3moL/L三氟乙酸2mL,密封后在120℃恒温中水解6h,用氮气吹干三氟乙酸,加甲醇并吹干,水解产物加进0.6mL0.05mol/LNaOH溶液,再加5mgNaBH4,室温下反应8—10h,加少许乙酸分解过量的NaBH4,至无气泡产生为止。蒸干反应液,以酸性甲醇洗涤反应产物,蒸干甲醇液,重复3—4次以除往硼酸根,最后加进甲醇蒸干并于烘箱中105℃除净水分;
(3)乙酰化衍生法取水解得的单糖3mg,加进0.5mL吡啶,1mL乙酸酐,加热2h,冷却后加甲苯2mL,用N2吹干,加进氯仿,蒸馏水洗涤,用N2吹干得到棕黄色产物。此乙酰化的单糖醇用CHC13稀释后进行
气相色谱-质谱分析;(4)三甲基硅烷化衍生法取水解得的单糖样品6mg,加吡啶0.6mL,六甲基四硅胺烷0.2mL,三甲基氯硅烷0.2mL,振荡,静置,取上清液进行
气相色谱-质谱分析。
2.3
GC-MS分析条件HP-5石英毛细管色谱柱(美国安捷伦公司),(50m×0.22mmi。d。,0.25μm);EI源,电子能量70eV,分子量扫描范围33—550,进样口温度260℃,接口温度270℃,载气氦气流速1.2mL/min,分流比20:1, 程序升温:100℃→1O℃/min150℃→15℃/min260℃(40min).
3、结果与讨论
3.1 菱角壳提取物中多糖的鉴定分析Molisch实验:硫酸和多糖溶液分为两层,层与层之间有紫色环出现。说明提取物确含糖。混合多糖F5纯品的FT-IR谱图。谱图中多处可见到多糖的特征峰,如:3435/cm,2924/cm的吸收峰分别为O—H,C—H的伸缩振动峰,1193/cm,1037/cm处的吸收峰是多糖中C—O,C—O—C伸缩振动和C—OH的弯曲振动特征峰,在1000—700/cm的吸收峰则是α-和β-吡喃单糖形成的特征。
混合多糖F5纯品的HNMR谱图。谱图中δ3.5—δ5.5之间可见多个糖质子的响应信号峰,其中δ4.605、δ4.7和δ4.9223个峰是β-吡喃环上的质子信号,而δ5.238、δ5.348、δ5.446、δ5.465和δ5.515则可能来自于α-吡喃环上的质子,由此可见,此多糖可能是由多种单糖组成。
3.2 菱角壳多糖中单糖组成的确定样品F1一F4水解产物的乙酰化衍生物经
气相色谱-质谱分析,通过与标准色谱图对照比较和质谱碎片解析,确定了其单糖组成及摩尔比。数据表明,4种多糖分别由不同摩尔比的几种单糖(如阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖)和二糖(乳糖、蜜二糖)组成,其中多糖F2一F4的单糖组成相同,只是摩尔比略有不同;而F1则由5种单糖和2种二糖组成。葡萄糖,半乳糖和甘露糖在4种多糖中占的比例较大,是菱角多糖的主要成分。
混合多糖样品F5的甲基硅烷化衍生物的
GC-MS,经碎片分析并利用标准质谱NIST库进行检索,l1个色谱峰被确以为单糖的甲基硅烷化衍生物。由于在衍生化过程中α型和β型吡喃和呋喃异构体的天生,同一单糖可以天生几种衍生物。因此,只检出5种单糖,其中包括两种戊糖(阿拉伯糖和木糖),3种己糖(甘露糖,半乳糖和葡萄糖)。从峰面积百分比数据还可以看出,葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖在该混合多糖中所占的比例较大,是菱角多糖的主要成分,这与乙酰化分析的结果基本一致。