主题：【分享】玄参内生真菌Nigrospora oryzae D7次生代谢产物研究

内生真菌几乎无处不在地存在于植物体内的各种组织中，是多种生物活性化合物的重要储存宝库^[1]。植物内生真菌作为一个巨大的资源库，与宿主共同进化，不仅能产生与宿主植物相似或相同的活性物质，还可以从中发现大量骨架新颖具有药用价值的次生代谢产物，是天然活性先导化合物的重要源泉之一^[2-5]。

黑孢属Nigrospora菌株广泛分布于自然界，虽然是常见的植物病原菌^[6]，但也是重要的药用动植物内生菌，能够产生多种次级代谢产物，主要有聚酮、蒽醌、萜、甾体和生物碱等，而且大部分化合物具有明显的抗菌、抗氧化、细胞毒、抗病毒和抗肿瘤等药理作用^[7-8]。有作为先导药物和环保的农用化学品的潜力，在农业植物保护和人类疾病治疗领域均显示出较大的应用前景。

内生真菌Nigrospora oryzae D7为首次从玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.根中分离得到。本实验将对玄参内生真菌N. oryzae进行次生代谢产物的研究，期望发掘结构新颖的活性先导化合物。最终分离得到11个化合物，分别鉴定4,5,8-三羟基-6-甲氧基-2-甲基-3-2-丙酰-3,4-二氢萘-1(2H)-酮 [4,5, 8-trihydroxy-6-methoxy-2-methyl-3-(2-oxopropyl)-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one，1]、(S)-2-甲基-2,3-二氢苯并呋喃-4-羧酸[(S)-2-methyl-2,3-dihydro- benzofuran-4-carboxylic acid，2]、3-羟基-2-甲氧基- 5,6-二甲基苯甲酸（3-hydroxy-2-methoxy-5,6- dimethylbenzoic acid，3）、2-乙氧基-3-羟基-5,6-二甲基苯甲酸（2-ethoxy-3-hydroxy-5,6-dimethylbenzoic acid，4）、2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲醛（2,4- dihydroxy-3,6-dimethyl benzaldehyde，5）、2,5-二甲基间苯二酚（2,5-dimethyl resorcinol，6）、2-(4-羟苯基)乙酸乙酯 [2-(4-hydroxyphenyl) ethyl acetate，7]、酪醇（tyrosol，8）、α-acetylorcinol（9）、(20S,22E,24R)-5α,8α-桥二氧-麦角甾烷-6,22-二烯- 3β-醇[5α,8α-epidioxy-(20S,22E,24R)-ergosta-6,22- dien-3β-ol，10]、(3β,5α,6β,22E)-麦角甾-7,22-二烯- 3,5,6-三醇[(3β,5α,6β,22E)-ergosta-7,22-diene-3,5,6- triol，11]、其中化合物1为新的萘醌类化合物，命名为稻黑孢醌A；活性测试结果表明化合物1对人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MDA-MB-435细胞株具有较强的生长抑制活性，半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC₅₀）分别为（9.25±1.60）、（11.37±2.10）μmol/L；化合物10和11对A549细胞的增殖有一定的抑制活性，IC₅₀分别为（25.23±2.50）、（27.48±1.90）μmol/L。

1  仪器与材料1.1  仪器与试剂Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Bruker Avance III 500 MHz型核磁共振波谱仪（德国布鲁克公司）；MJ-150-I型霉菌培养箱（上海精密仪器仪表有限公司）；BSD-YX（F）3400立式摇床（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）；RE-52C旋转蒸发仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；YXQ-LS-75SⅡ立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯）；Nicolet IS50型光谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；JASCO J-810型圆二色光谱仪（日本分光株式会社）；岛津 LC-MS 8050型质谱仪（日本岛津株式会社）；CYTATION型多功能酶标仪（美国BioTek公司）。柱色谱硅胶（200～300、400～500目）；反相柱（YMC Pack ODS-A（250 mm×10 mm，5 μm），日本YMC公司）；TLC（HSGF₂₅₄硅胶预制板，烟台黄务硅胶开发实验厂）。二氯甲烷、石油醚、乙醇、甲醇、醋酸乙酯等（分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司），甲醇（高效液相色谱级，中国医药集团上海化学试剂公司）；阿霉素（批号S17092，上海源叶生物科技有限公司）。PDA培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL）。PDB培养液（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL）；二甲基亚砜（DMSO，上海生工生物工程有限公司）；CCK-8试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；DMEM培养基和特级胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）。1.2  菌株来源本研究所用菌株分离自新鲜玄参根（2017年11月采自浙江磐安大盘镇），植物经浙江中医药大学秦路平教授鉴定为玄参S. ningpoensis Hemsl.，菌株经上海生工生物工程有限公司鉴定为Nigrospora oryzae（Genbank序列号MH782625）。样本储存于浙江中医药大学药学院。1.3  细胞株A549细胞和MDA-MB-435细胞购自中国科学院上海细胞库。
2  方法2.1  菌株发酵将内生真菌D7接入250 mL锥形瓶中（含100 mL PDB培养基），26 ℃，180 r/min旋转摇床培养7 d后，转接入5 L锥形瓶（含3 L的PDB培养基），培养10瓶，静置于恒温培养箱中，于28 ℃，培养10 d，得到30 L左右的发酵液。2.2  次生代谢产物的提取与分离将内生真菌N. oryzae D7的发酵物用甲醇浸提3次，粗提液用醋酸乙酯萃取后得到醋酸乙酯部位浸膏约14.5 g，将该浸膏经硅胶柱色谱，石油醚-醋酸乙酯系统（40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶2）梯度洗脱，经TLC检测合并分成10个组分（Fr. A1～A10）。对A1-1组分进行硅胶柱色谱、HPLC纯化（甲醇-水62∶38，1 mL/min），得到化合物1（t_R＝35.1 min，2.4 mg）；对A2-1组分进行硅胶柱色谱、HPLC纯化（甲醇-水58∶42，1 mL/min），得到化合物9（t_R＝19.0 min，2.2 mg）、10（t_R＝24.1 min，2.9 mg）、11（t_R＝32.4 min，2.4 mg）、12（t_R＝45.3 min，2.7 mg）；对A2-3组分进行硅胶柱色谱、HPLC纯化（甲醇-水70∶30，1 mL/min），得到化合物2（t_R＝40.0 min，3.1 mg）、3（t_R＝34.3 min，2.1 mg）、4（t_R＝38.3 min，2.3 mg）、5（t_R＝45.3 min，2.6 mg）。将A4-3-1组分进行凝胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、HPLC纯化（甲醇-水52∶48，1 mL/min），得到化合物6（t_R＝32.5 min，2.7 mg）、7（t_R＝22.5 min，2.4 mg）、8（t_R＝46.2 min，2.4 mg）；对A7-1组分进行硅胶柱色谱、HPLC纯化（甲醇-水56∶44，1 mL/min），得到化合物13（t_R＝21.0 min，3.2 mg）、14（t_R＝25.1 min，3.4 mg）、15（t_R＝32.6 min，3.4 mg）。
3  结果3.1  结构鉴定化合物1：黄色粉末，溶于甲醇，丙酮。10%硫酸乙醇显色剂显棕色。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z293.102 5 [M－H]^?，结合¹H-NMR、¹³C-NMR，知其分子式为C₁₅H₁₈O₆；¹H-NMR谱中可观察到1个双峰甲基1.16 (3H, d, J= 7.0 Hz)、1个单峰甲基2.08 (3H, s) 以及1个甲氧基3.92 (3H, s)，在低场有1个单峰苯环质子信号6.47 (1H, s)。在碳谱中显示共有15个碳信号，其中1个为连氧碳信号55.3（CH₃）、1个甲氧基碳、2个羰基碳信号208.3（C），204.5（C），1个甲基碳信号10.7（CH₃）。在高场有5个碳，低场有6个双键或苯环碳，结合以上信号可以推测化合物1为1个萘醌类化合物，且结构与已知化合物fusarnaphthoquinone A^[9]极为相似，但该结构有1个明显的甲基质子信号1.16 (3H, d)。在二维谱¹H-¹H COSY 中观察到H-7和H-12，H-6和H-7相关信号，确定了H-5/H-6/H-7/H-12的连接顺序（图1）。HMBC谱显示，H-2与C-1、C-3、C-4和C-4a相关，甲氧基CH₃-13与C-3相关，说明苯环的存在以及甲氧基在取代在苯环3位；H-5与C-4a相关，CH₃-12与C-8、C-7、C-11相关，证明了母核右侧还原醌环的存在，以及位于7位的甲基CH₃-12取代；另外，H-5、H-7和CH₃-12都与C-9相关，CH₃-11与C-9和C-10相关，又结合其碳谱和氢谱数据，确定9位有甲酰基取代。至此，该化合物的平面结构得以确定，鉴定为4,5,8- trihydroxy-6-methoxy-2-methyl-3-(2-oxopropyl)-3,4- dihydronaphthalen-1(2H)-one，为1个新化合物，命名为稻黑孢醌A。该化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR数据归属见表1。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]化合物2：透明无定型粉末；HR-ESI-MS m/z: 179.070 4 [M＋H]⁺，推测其分子式为C₁₀H₁₀O₃；¹H- NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 11.03 (1H, s, -COOH), 7.41 (1H, td, J = 7.9, 2.4 Hz, H-6), 6.89 (1H, dd, J =8.4, 2.5 Hz, H-7), 4.73 (1H, dq, J = 6.8, 4.4 Hz, H-2), 2.93 (2H, d, J= 6.6 Hz, H-3), 1.53 (3H, dd, J = 6.4, 2.4 Hz, 2-Me)；¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ: 170.1 (COOH), 162.3 (C-7a), 139.5 (C-4), 136.3 (C-6), 118.0 (C-7), 116.4 (C-5), 108.4 (C-3a), 34.8 (C-3), 20.9 (2-Me)。与参考文献对比^[10]，数据一致，鉴定化合物2为 (S)-2-甲基-2,3-二氢苯并呋喃-4-羧酸。化合物3：透明无定型粉末；HR-ESI-MS m/z: 197.081 0 [M＋H]⁺，推测其分子式为C₁₀H₁₂O₄；¹H- NMR (600 MHz, MeOD) δ: 6.22 (1H, s, H-4), 3.89 (3H, s, 2-OCH₃), 2.42 (3H, s, 5-CH₃), 2.00 (s, 3H, 6-CH₃)；¹³C-NMR (150 MHz, MeOD) δ: 174.0 (COOH), 164.2 (C-1), 161.5 (C-2), 140.9 (C-3), 111.5 (C-4), 109.9 (C-6), 105.0 (C-5), 52.0 (OCH₃), 24.3 (5-CH₃), 8.0 (6-CH₃)。与参考文献对比^[11]，数据一致，鉴定化合物3为3-羟基-2-甲氧基-5,6-二甲基苯甲酸。化合物4：透明无定型粉末；HR-ESI-MS m/z: 211.097 1 [M＋H]⁺，推测其分子式为C₁₁H₁₄O₄；¹H- NMR (600 MHz, MeOD) δ: 6.21 (1H, s, H-4), 4.38 (2H, qd, J = 7.1, 1.4 Hz, 2-OCH₂CH₃), 2.45 (3H, s, 5-CH₃), 2.00 (3H, s, 6-CH₃), 1.40 (3H, td, J = 7.1, 1.3 Hz, 2-OCH₂CH₃)；¹³C-NMR (150 MHz, MeOD) δ: 173.6 (COOH), 164.3 (C-1), 161.5 (C-2), 140.9 (C-3), 111.6 (C-4), 109.9 (C-6), 105.1 (C-5), 62.1 (2-OCH₂CH₃), 24.5 (5-CH₃), 14.6 (2-OCH₂CH₃), 7.9 (6-CH₃)。以上数据与文献报道一致^[11]，故鉴定化合物4为2-乙氧基-3-羟基-5,6-二甲基苯甲酸。化合物5：透明无定型粉末；HR-ESI-MS m/z: 167.070 9 [M＋H]⁺，推测其分子式为C₉H₁₀O₃；¹H- NMR (600 MHz, MeOD) δ: 10.03 (1H, s, H-7), 6.22 (1H, s, H-5), 2.47 (3H, s, H-9), 1.98 (3H, s, H-8)；¹³C- NMR (150 MHz, MeOD) δ: 194.4 (C-7), 165.2(C-4), 165.1 (C-2), 142.9 (C-1), 113.7 (C-6), 110.9 (C-3), 110.1 (C-5), 18.0 (C-9), 7.1 (C-8)。与参考文献对比^[12]，数据一致，鉴定化合物5为2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲醛。化合物6：透明无定型粉末；HR-ESI-MS m/z: 139.076 1 [M＋H]⁺，推测其分子式为C₈H₁₀O₂；¹H- NMR (600 MHz, MeOD) δ: 6.14 (2H, s, H-3, 5), 2.13 (3H, s, H-8), 1.99 (3H, s, H-7)；¹³C-NMR (150 MHz, MeOD) δ: 157.0 (C-1, 3), 136.9 (C-5), 109.0 (C-2), 108.3 (C-4, 6), 21.3 (C-8), 8.2 (C-7)。与参考文献对比^[12]，数据一致，鉴定化合物6为2,5-二甲基间苯二酚。化合物7：透明无定型粉末；HR-ESI-MS m/z: 181.086 3 [M＋H]⁺，推测其分子式为C₁₀H₁₂O₃；¹H- NMR (600 MHz, MeOD) δ: 7.04 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-4, 8), 6.71 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-5, 7), 4.19 (2H, t,  J = 7.1 Hz, H-1), 2.82 (1H, t, J = 7.1 Hz, H-2), 2.00 (3H, s, CH₃)；¹³C-NMR (150 MHz, MeOD) δ: 172.9 (COOCH₂), 157.1 (C-6), 130.9 (C-4, 8), 130.0 (C-3), 116.2 (C-5, 7), 66.6 (C-1), 35.2 (C-2), 20.8 (CH₃)。与参考文献对比^[13]，数据一致，鉴定化合物7为2-(4-羟苯基)乙酸乙酯。化合物8：透明无定型粉末；HR-ESI-MS m/z: 139.076 0 [M＋H]⁺，推测其分子式为C₈H₁₀O₂；¹H- NMR (600 MHz, MeOD) δ: 7.03 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-4, 8), 6.71 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-5, 7), 3.68 (2H, t,  J = 7.2 Hz, H-1), 2.71 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-2)；¹³C-NMR (150 MHz, MeOD) δ: 156.7 (C-6), 130.9 (C-3, 4, 8), 116.1 (C-5, 7), 64.6 (C-1), 39.4 (C-2)。以上数据与文献报道一致^[14]，鉴定化合物8为酪醇。化合物9：透明无定型粉末；HR-ESI-MS m/z: 154.086 1 [M＋H]⁺，推测其分子式为C₈H₁₁NO₂；¹H- NMR (600 MHz, MeOD) δ: 6.41～5.86 (3H, m, H-2, 4, 6), 3.54 (2H, s, H-7), 2.12 (3H, s, 9-CH₃)；¹³C-NMR (150 MHz, MeOD) δ: 209.5 (C-8), 159.9 (C-3, 5), 137.8 (C-1), 108.9 (C-2, 6), 102.3 (C-4), 51.7 (C-7), 28.9 (C-9)。和参考文献一致^[15]，鉴定化合物9为α-acetylorcinol。化合物10：无色油状物；HR-ESI-MS m/z: 443.352 1 [M＋H]⁺，推测其分子式为C₂₉H₄₆O₃；¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 6.50 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6), 6.24 (1H, d, J= 8.4 Hz, H-7), 5.22 (1H, dd, J = 15.3 Hz, H-23), 5.17 (1H, m, H-22), 3.97 (1H, m, H-3), 0.99 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-21), 0.91 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-28), 0.88 (3H, s, H-19), 0.88 (3H, d, J = 6.9 Hz, H-26), 0.82 (3H, s, H-18), 0.81 (3H, m, H-27)；¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 135.6 (C-6), 135.6 (C-22), 132.6 (C-23), 130.9 (C-7), 82.3 (C-5), 79.6 (C-8), 66.6 (C-3), 56.3 (C-17), 51.9 (C-14), 51.3 (C-9), 44.7 (C-13), 43.2 (C-24), 39.9 (C-20), 39.5 (C-12), 37.1 (C-4), 37.1 (C-10), 34.9 (C-1), 33.3 (C-25), 30.3 (C-2), 29.0 (C-16), 23.6 (C-11), 21.1 (C-21), 20.8 (C-15), 20.3 (C-26), 19.8 (C-27), 18.3 (C-19), 18.2 (C-28), 13.0 (C-18)。与文献对照一致^[16]，确定化合物10为5α,8α-epidioxy-(20S,22E,24R)- ergosta-6,22-dien-3β-ol。化合物11：无色固体；HR-ESI-MS m/z: 431.352 3 [M＋H]⁺，推测其分子式为C₂₈H₄₆O₃；¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ:5.39 (1H, s, H-7), 5.18 (2H, m, H-22, 23), 4.09 (1H, m, H-3), 3.63 (1H, brs, H-6)；¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 33.1 (t, C-1), 31.0 (t, C-2), 67.9 (d, C-3), 39.7 (t, C-4), 76.1 (s, C-5), 73.9 (d, C-6), 117.7 (d, C-7), 144.2 (s, C-8), 43.6 (d, C-9), 37.3 (s, C-10), 22.2 (t, C-11), 39.4 (t, C-12), 43.9 (s, C-13), 54.9 (d, C-14), 23.1 (t, C-15), 28.3 (t, C-16), 56.1 (d, C-17), 12.4 (q, C-18), 19.0 (q, C-19), 40.6 (d, C-20), 21.3 (q, C-21), 135.8 (d, C-22), 132.4 (d, C-23), 43.2 (d, C-24), 33.4 (d, C-25), 20.3 (q, C-26), 19.8 (q, C-27), 18.2 (q, C-28)。与文献报道对照^[17]，鉴定化合物11为 (3β,5α,6β,22E)-ergosta-7,22-diene-3,5,6- triol。3.2  肿瘤抑制活性测试采用CCK-8法测定化合物对MDA-MB-435细胞和A549细胞的细胞毒性。首先，细胞在高糖DMEM（含有10% FBS＋0.5%双抗）培养基中培养。培养48 h后，取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化，取浓度在4×10⁴～5×10⁴个/mL的细胞接种到96孔板中，放置37 ℃、5% CO₂培养箱中过夜。24 h后将11个化合物，阳性对照阿霉素及空白对照加入96孔板中，设5个复孔，加药后放置于37 ℃、5 % CO₂的培养箱中培育48 h。吸去上清，每孔加入90 μL新鲜培养液和CCK-8（10 μL），同样条件下继续培养4 h后，用酶标仪在450 nm处读取A值，计算细胞生长抑制率。筛选出的抗肿瘤抑制率大于50%的内生真菌，设置6个浓度梯度（3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL），运用Logit法计算IC₅₀。抑制率＝(A_对照—A_给药)/(A_对照—A_空白)活性测试结果表明，化合物1对A549细胞和MDA-MB-435细胞具有较强的生长抑制活性，IC₅₀分别为（9.25±1.60）、（11.37±2.10）μmol/L；化合物10和11对A549细胞的增殖有一定的抑制活性，IC₅₀分别为（25.23±2.50）、（27.48±1.90）μmol/L。其余化合物对A549和MDA-MB-435细胞增殖的抑制活性较弱，在初筛50 μmol/L下，抑制率低于50%。
4  讨论本实验综合利用多种色谱分离技术对药用植物玄参内生真菌N. oryzae D7的次级代谢产物进行了化学研究，并运用谱学技术鉴定了化学结构，发现了1个新的萘醌类化合物，以及10个已知化合物。化合物2曾在松叶内生真菌的次生代谢产物中分离得到并有一定的抑菌效果^[10]。化合物3和4曾在石斛属里分离得到^[11]。化合物6是1个酚类化合物，该化合物曾在长松萝Usnea diffracta Vain中分离得到^[12]。化合物7曾在见血封喉内生真菌Acremonium sp. J1次生代谢产物中分离得到^[13]。玄参内生真菌是一个丰富的资源库，薄层色谱显示N. oryzae醋酸乙酯部位的成分比较多且容易分离，所以首先分析醋酸乙酯部分并再继续分离其余部分。内生真菌N. oryzae的分离只是其中很小的一部分，还有大量内生真菌的代谢产物还有待于进一步研究利用。药用植物内生真菌因其极其丰富的多样性以及蕴含丰富新颖的次生代谢产物，能为天然药物研发等工作开辟新的途径，具有极为广阔的应用前景。