主题：[推荐]GC分析的ABC---烘箱中發生的事情等(ZT)

GC分析的ABC---split與splitless
現在就讓我們來看看split和splitless到底是怎麼回事!!

split
大家應該都知道split mode的注射方式應用於濃度較高的分析樣品,注射時分流閥會打開,當樣品打入liner氣化後,大部分都分流出儀器以外,只有小部分進入管柱中,為了盡量維持進入管柱中的那部分樣品組成能與原來樣品的組成相符,所以這種注射方式的關鍵就在於樣品氣化的速度與程度. 

    要使汽化快速而且完全,首先就得有夠高的injector溫度和適當的liner,split用的liner特點就是管內供給汽化所用的表面積超多,螺旋狀的,杯狀的....一大堆各式奇怪的形狀都有,但我始終覺得還是填塞玻璃棉效果最好,容易更換,還可以隨意調整高低. 當然,你還得注意liner的容量,當樣品在liner中汽化後,他的體積會突然間快速膨脹幾百倍, 容量不足的liner會使汽化及未汽化的樣品由septum purge的出口被推擠出去,因而產生流失. 這種突然產生的壓力波, 可以由慢速的注射方式(也就是說使plunger慢慢的將樣品推入liner中)可以降低這種影響, 但卻會形成注射口的discrimination,亦即造成高沸點的被分析物無法和低沸點的分析物一同進入管柱中, 常見的狀況就是圖譜中時間越往後面的,尖峰面積也越來越小. 最恰當的注射方式就是使用快速注射法, 同時搭配hot needle(前面有post提過)或者是solvent flush法, solvent flush法就是注射針先吸一段溶劑, 再往上拉一段空氣,然後才是將樣品吸入注射針中, 利用溶劑再快速的
注射法中, 將整個樣品推出針外! 

    注射針插入liner中的深淺位置也會影響, 針尖越接近管柱入口, 越能使更多的樣品進入管柱中！！
   
Splitless
    用於分析低濃度樣品的splitless模式注射法, 為了使樣品能完全進入管柱中, 所以當然會關閉分流閥! 所以這也就使得受到上面所說的壓力波影響, 要比split法大得多, 所以要有好的注射結果,使用慢速注射法似乎解決的方法之一, 當樣品被緩慢的推入liner中(當然可以加上hot needle法, 但是千萬不能用solvent flush法！), 在splitless的模式下, 無論高或低沸點的分析物,都會有足夠的時間汽化進入管柱中, 直至purge的時間一到,閥門打開後, 那些為氣化的
東西才會被掃出儀器外,看似單純, 其實不然, 比前述的split要複雜多了.!!

    你使用的溶劑沸點最好能比在你分析物中沸點最低的那個物質還要低個20度左右, 不然有可能使那些分析物產生拖尾的狀況! 這個現象我還真的碰過, 換了種溶劑, 拖尾的現象還真的是改善了(產生的原因大家可以猜猜看,考考大家的功力!!).

    當然, splitless注射方式可以讓樣品有較長的時間停留在注射口中,因此可以使用較低的注射口溫度, 但是隨著鎔劑大量進入管柱中, 當開始升溫時, 溶劑所造成的solvent peak卻也會影響分析結果, 所以你要找一個適當的purge時間, 時間一到就把未汽化的東西掃出儀器以外, purge時間太長, solvent peak就有可能大到拖尾,影響到低沸點分析物的積分值, 或者是整個覆蓋了分析物. 一個好的purge時間, 所獲得的solvent peak是長方形的(當然, 你要是用GC/MS的話, 由於solvent delay時間的設定, 你不會看到這個長方形, ECD等有選擇性的偵測器也是看不到的), 如果是獲得拖尾的形狀就表示你的purge time設得太長了!

    當然, 事情還沒結束, 如果你夠心細, 你會發現一個問題: 長時間的氣化, 長時間的進入管柱, 要用甚麼方法才能讓分析物在管柱中不會產生band broad 或者是在圖譜上產生拖尾的狀況(split的快速汽化及分流,沒這方面的問題)?, 這就需要一個溫度夠低的烘箱.所以有時烘箱起始溫度需要降到三十度以下(甚至於還有更低的), 不是沒道理的!!

最近的幾篇有關管柱的討論,其中的某些觀點似乎是值得拿出來再加以澄清的,當然這是我的看法,如果有不同的論點也是可以再提出來......毛細管柱一般都不會便宜, 在進行某些步驟時需要多多考慮一下!!

1. 新的管柱需要再加以condition( 老化)嗎??
  當然需要! 但絕對不需要花整夜的時間來condition! 尤其是不論青紅皂白的在持續高溫下整夜的加熱condition,這對管柱其實是很大的傷害,就算是一支嚴重污染的管柱都不一定需要如此做,更何況還是一支新的. 事實上,在管柱的包裝盒中都會有告訴你這一支新管柱的Condition方法,照著做,如果無法達到你的要求, 再換更激烈一點的方法還不遲!

2. 使用過的管柱要怎麼做Condition?
  最大的忌諱就是前一項中所提的,絕對不要長時間在高溫下烘烤你的管柱,即使你的溫度已經調到管柱的最高耐溫下30度,也不要如此做!!  Condition應採低溫==>高溫==>降溫==>升溫==>高溫==>降溫.....的模式操作,就是在一個操作的program中設定好多次的升降溫度. 那麼高溫要到幾度? 兩種做法:一是依照你管柱所能承受的最高溫度再降30度. 另一種就是你分析時所用之program的最高溫度. 我通常都是使用第一種的設定方式.

3. 到底要Condition到甚麼程度下才可以正式run樣品?
  這要看你儀器感度和分析的需要,而不是一成不變的用同一個標準! 如果你是分析高濃度,幾個ppm以上的樣品,其實你的管柱不需要太多的Condition! 如果你的分析物出來的時間較後面,且濃度較低的話,就必須使用比較嚴苛一點的方式和久一點的時間了! 例如在我的實驗中,如果是需要低濃度接近MDL的分析考試, 在前一天的下班時,就會設定一連串空針的空針(使用明天要用分析program ), 一直run到正式的樣品上機為止.

4. 管柱可以用有機溶劑清洗嗎?
  一般WCOT和cross link的管柱都沒問題! 在DB和HP的管柱使用說明中就有說明哪些DB和HP系列的管柱不可以使用有機溶劑清洗.

5. 甚麼東西是絕對不可以注射進入管柱的?
  無機酸和鹼是最大的忌諱,幾乎所有類型的管柱都無法忍受!!

6. 水呢? 可以用水清洗管柱嗎? 可以直接注射水樣進入管柱嗎?
  其實最近的一些討論內容中,水是否可以進入管柱中,是個討論的重點, 一般GC分析員的的觀念中,視水為GC管柱及GC儀器本身的大敵, 但事實上水沒那麼可怕! 除了幾種靜相之外,水不但可以可以直接注射進入管柱中,甚至於可以如有機溶劑一般來清洗管柱.
  在手上的一篇J&W公司(DB管柱的製造廠商)的資料中顯示(很久以前從網路下載的,已經忘掉位址了),在三種靜相性質完全不同的管柱:DB-wax, DB-1和DB-225,分兩種狀況來實驗,一是以水樣注射,第二種是先以3mL的水清洗,在依序接著以1mL的甲醇,二氯甲烷,正己烷等沖洗後,以相同的物質在前述兩種實驗方式的前後分別注射(不同的管柱分析物並不相同),可以獲得下列的數據:( "before Inj.表示為實驗前, "After Inj.表示為注射水樣後,"After rinse表示為以水清洗後)


DB-1
Parameter            Before Inj.    After Inj.  After Rinse
Ret. Factor          14.6          14.5        14.5
Ret. Index 1        1349.88        1350.02      1350.05
Ret. Index 2        1427.77        1428.16      1428.07
Theor. plates        1448          1474        1391
Bleed(pA)            12.8          11.2        21.5
                 

DB-wax
Parameter            Before Inj.    After Inj.  After Rinse
Ret. Factor          12.6          12.6        11.7
Ret. Index 1        1149.54        1149.73      1150.82
Ret. Index 2        1163.44        1163.71      1164.13
Theor. plates        1277          1261        1268
Bleed(pA)            50.5          97.8        97.6
Bleed2              42.2          41.0        39.6


DB-225
Parameter            Before Inj.    After Inj.  After Rinse
Ret. Factor          11.5          11.4        11.2
Ret. Index 1        1622.30        1621.26      1620.97
Ret. Index 2        1711.51        1711.03      1710.77
Theor. plates        1101          1110        1160
Bleed(pA)            15.0          114.0        53.9

大概的結論是:
a. 管柱注射水樣後對於:polarity, selectivity,  retention time, efficiency, activity等並無太大的改變.
b.對於管柱的Bleeding方面:100%的DMPS無影響,但PEG和50%的cyanopropyl phase仍需繼續觀察下去.
c.Non polar管柱對於注射水樣和以水清洗管柱並無影響, 對於polar 的管柱(bonded,和cross-link)而言, 水樣的注射亦無影響. 但不推薦使用水去清洗管柱.

在我還是研究生的階段,就已經使用FID,直接注射水樣來分析五氯酚的實驗....

  至於有人說注射水樣會使得FID的火熄滅,其實應該要先檢討一下空氣和氫氣的流速和流速比是否正確.....但是ECD則持保留的態度, 那東西是超級怕水的!!


7. 分析的後段在高溫時, base line會隆起,需要condition管柱嗎?
  毛細管柱在烘箱中,除了在是溫以外,只要溫度一升高,就一定會產生bleeding, 在高溫時當然最多,尤其是當你使用膜厚較大的管柱時,這種情況特別嚴重! 需不需要就看你要求的偵測極限,當管柱的bleeding大到遮住你的分析物時, 這時你再怎麼去加熱Condition也沒有用! 還不如視情況換一支較小膜厚的管柱......

liner的去活化方法
有網友詢問, 所以還是貼出來讓大家看看,有需要的就拿去用........

liner在去活化之前應先用溶劑或肥皂水將其刷洗乾淨, 另外可以用木質柄的棉花棒, 於溶劑或肥皂水中刷洗liner的玻璃管內部, 如無木質柄的棉花棒,則一般的塑膠柄的棉花棒則只可於肥皂水中刷洗, 最後沖洗乾淨,乾燥後進行去活化的步驟.

乾燥後的liner先以玻璃吸管吸取甲醇沖洗, 反覆數次, 然後溶劑換成EA,以玻璃吸管吸取沖洗liner, 最後把溶劑換成n-hexane重覆前面所述的步驟,  要注意的是溶劑使用順序不可以變動!!

將二氯二甲基矽烷和甲苯以1:9的體積混合,並以錶玻璃加蓋 ,需注意盛裝這個混合液的玻璃容器,本身也會與前述的混合液反應, 故在使用後會有一段時間其容器內部會呈現疏水性質,  將前面以n-hexane洗乾淨的liner放入其中,要注意在liner的管壁上絕對不可以出現氣泡, 當所有的liner都放好後,蓋上錶玻璃, 於抽氣廚中靜置1~2小時 !!

將反應完成之liner取出(每次一支, 其餘的浸泡在反應劑中,絕對不要一次將所有的liner拿出來暴露於空氣中), 先以玻璃吸管吸取n-hexane沖洗, 然後以EA沖洗, 最後是以甲醇沖洗,順序不可以顛倒!!  n-hexane是要洗掉未反應的二氯二甲基矽烷, 而最後的甲醇是要和在已經和玻璃表面反應的二氯二甲基矽烷, 另外的一個-Cl基團反應(end cap),  所以如果順序搞錯的話是很淒慘的事情.........

上面的步驟結束後,可以將liner置於高溫烘箱中,在300度下烘一個晚上!!  隔天早上取出時, 須於乾燥皿或烘箱中降溫, 而不要於空氣中, 這樣你的liner會很快速的開始吸收水氣....
最後將liner置放於防潮箱中保存!!

反應的副產物是氣態HCl, 要全程在抽氣廚中操作!!!     
二氯二甲基矽烷會與空氣中的水分反應, 注意存放的條件!!

內標準品的選擇

    傳統上在教科書中都會很模糊的告訴學生內標準的選擇方式,例如說要選安定性好;與分析物性質要相近;在分析的基質中不能出現等,現在我對這些個" 選擇方式"沒有太大的興趣,因為這個大家都知道,那現在就從另一個角度的來看看內標準品的選擇還有哪些需要注意的.


1. 只選一個內標準品?

  當然, 如果你的分析目標物就只有一個, 在正常的狀況下,內標準"應該"也只會有一個才對! 但是如果你的分析是多成份的,那就必須十分小心地看待在一個分析方法內標準品的選擇, 如果分析物的在層析圖中是平均分布在各處, 那你就必須看看你的檢測方法中是否有規定內標物與分析物之間的滯留時間差範圍是多少,依此規定來選擇內標,但是如果並沒有規定,最好也是選擇一個以上的內標來使用,因為即使化學性質不會差太多,但在沸點方面卻會有滿大的差異, 內標與分析物的沸點差異過大,在GC的注射口中就無法把因為discrimibation所造成的誤差校正回來.


    如果你的分析物是性質相差頗大的 (例如說同時含有醇,酸...),那別懷疑一定是要使用一個以上的內標準品,如果多個物種再加上多成份,那就很複雜了. 最低的限度也要依照分析物的沸點高低來使用多個不同的內標準品. 在美國環保署的檢驗方法USEPA 8270C,是一個檢測半揮發性的污染物的規範,前後列了不下一百種的分析物,就使用了六個不同的內標準品作為校正的依據,來照顧到各個不同沸點的分析物!!

    濫用藥物分析大概是最嚴謹的了,即使是結構性質極相近的分析物,例如morphine和codeine,amphetamine和methamphetamine,在分析時為求準確,都是以各自的D同位素取代的標準品作為內標.




2.基質中一定不能存在?

    這個問題當然是肯定的, 不然定量結果會很不穩定或者是很淒慘. 但是有些時候你根本不知道哪些東西在分析樣品的基質中不會存在! 這時候怎麼辦? 找以往的文獻看看別人是用甚麼,這是一個方法, 但要注意的是文獻不一定就是對的! 使用分析物的氫同位素(D)取代物,是最妥當的,但問題是價格昂貴,而且不是每一種分析物的氫同位素(D)取代物都有販售,當然,如果本錢夠,你可以去訂購專門替你合成氫同位素(D)取代物. 如果要自己選, 那就必須了解一下分析物的成分了.

    以前曾經替人定性和定量過一陣子海水魚中所含不飽和脂肪酸,這魚中不飽和脂肪酸的碳數都是奇數(或是偶數, 我已經忘了), 所以內標就使用了幾個偶數(或奇數)的不飽和脂肪酸, 像這種內標物絕不可能出現在分析物中,且性質十分相近,所以定量的結果一般誤差都不會太大! 如果完全無法確定怎辦? 有時候就是賭一賭囉.........舉例來說:如果你的分析物結構中含有氯的話,就可以尋找一個化合物,而這個化合物是把其中的氯換成氟或溴,例如你可以使用2-氟聯苯或2-溴聯苯來當作分析2-氯聯苯的內標準品. 以環境分析為例,通常在自然界中的氟及溴化物並不多, 在EPA的方法中,就經常把結構相似的氟及溴化物添加入樣品中,來做為分析含氯化合物的QC樣品.所以找氟及溴來取代氯原子的化合物來作為內標,基本上還算是很安全的.

    如果實在連上述轉換一個基團的內標都找不到,那至少在選擇時一定要找同一類的,分析酸就找酸當內標,分析醇就找醇當內標,直鏈結構分析物就不要找一個環狀的化合物來當內標,分子量不要相差太大,這算是最基本的要求!!

3.內標和分析物的滯留時間必須接近?

    這個說法原則上沒錯,因為如果滯留時間接近,它們的物理或者是化學的性質在某種程度上是接近的,所以有些分析方法會有這樣的規定. 但在某些特殊的狀況下卻出了問題, 事實上還真的碰過, 結果在更換到第三個內標準品後, 它的RT遠離分析物, 反而解決了定量誤差的問題!!  這個案例以後有空在來聊聊.   




4.內標的濃度應該是多少?

    除了某些分析方法會規定必須加入多少濃度的內標外,其他的就只能靠分析員自己來決定了. 以我為例, 通常會先決定一個分析方法的檢量線範圍,然後開始配製不同濃度的內標準品來注射入儀器中,分析完後選出一個大概是檢量線最高濃度的波峰高度三分之二左右的濃度,作為該項分析的內標濃度. 這樣的選擇方式,可以兼顧到高低濃度的需要,一般來說,內標濃度過高除了會增加成本之外,對於低濃度的校正是會產某些程度的誤差.

    在某些分析方法中會強制妳使用內標法而不是外標法或線性迴歸的方式來定量,但是如果你的基質很複雜,一針打進儀器中,結果大大小小的出來一堆波峰, 這個時候如果你又不是使用質譜作為偵測器的話,就必須考慮加大內標準品的使用濃度, 來降低內標準品的可能發生的積分誤差!!




5.內標準怎麼配製?

    一但決定了添加內標準品的濃度,就可以開始配製分析時所用的內標準品標準溶液,相對於測試時的小量, 分析員必須先估計妳在這一批的分析樣品有多少, 然後計算整個分析需要添加入多少的量,例如說妳需要大概100mL的內標準品標準溶液,這時就必須再加多30%以上,一次就配好整個分析要用的量! 分裝或者是整瓶放到-20度的冰箱中存放,免得做到一半發覺內標準品標準溶液用完了,再重新配製一次,如果你是分析的新手, 搞不好前後兩次配得不一樣濃度,那就會很悽慘了…..有些領域的分析,很重視這種內標波峰的積分值是否是有一定的再現性!!

這一部分的內容對於色層分析的新進人員, 無論是GC或HPLC, 多多少少都會有一點幫助, 尤其是覺得檢量線老是
有問題的分析人員, 可以參考一下.....

1.檢量線的種類有哪些?
通常校正之檢量線大概可以分為兩大類: 線性(linear)與非線性(nonlinear). 線性校正檢量線為直線通過原點(0,0)的零次校正,和不通過原點的一次校正. 而非線性校正則為二次校正或更高次的校正. 今天的重點則是放在最常使用的線性校正上.線性校正在實際的使用時,最常見的就是"線性回歸校正法"(linear regression), 感應因子法(內標法)及校正因子(外標法)等三種.

2.檢量線的最高及最低濃度差的限制是多少? 最低濃度要怎麼設定?
這個其實並沒有明確的規定, 視各分析的領域而定,當然唯一的要求就是一定要在線性範圍之內, 通常會要求liner regression法的 r 值在0.995以上, 而內(外)標法感應(校正)因子相對標準偏差必須小或等於20%.在實際的使用上, 高低濃度差越大,將會得到更大的誤差, 這種誤差在整個檢量線中,以低濃度的範圍最大, 高濃度的範圍次之, 以檢量線的中段最小, 這其實是很容易了解的, 因為所謂線性回歸,就是把一條曲線硬是拉成一條直線來使用, 這種由彎曲而拉成直線的誤差 , 以在檢量線的頭尾兩端最大,在以百分率表示時,低濃度的誤差就變成一條檢量線中最大的了.
在儀器分析中, 高低濃度差還要考慮到偵測器的線性範圍, 通常就我本身所用的分析檢量線,一般最高與最低濃度差,大概都在10倍左右, 最低濃度"盡量"設定在MDL的3.3倍左右, 如果你用的是LOD, 也就設定在LOD的3.3倍,雖然LOD和MDL並不一樣........, 另外, 如果知道分析樣品的大概濃度, 也最好盡量調整樣品的濃度, 讓待測物的濃度位於檢量線最高濃度的20%～80%之間!!

3.甚麼樣的檢量線才可以用!?
當然,前提是必須先符合前面所說的: liner regression法的 r 值在0.995以上, 而內(外)標法感應(校正)因子相對標準偏差必須小或等於20%. 如果你的分析方法夠嚴謹,就有下面更進一步的管制標準: 你必須注射一針標準品, 通常是檢量線的中間濃度, 分析後的數據代回校正方程式, 如果誤差在20%或15%(對於linear regression是濃度偏差, 內標法是感應因子相對標準偏差, 外標法則是校正因子相對標準偏差  )以內才算是及格可以使用,否則就必須重新製作檢量線. 更嚴謹的作法是以第二個標準品來源(通常就是與製作檢量線之標準品不同製造商), 配製檢量線中間點的濃度,如前一般注射分析計算, 通過前述的管制標準才可以!
以往所見過管制最嚴格的 方法, 在藥物分析 BA/BE測試, 甚至於規定檢量線中每一點所得的積分值皆須代回線性方程式中計算濃度, 如與本身誤差超過15%就算不合格....
就linear regression而言, 如果你相信 r大於或等0.995, 這一條檢量線就可以拿來定量, 有時會有悲慘的後果, 因為這樣會產生很大的誤差! 例如很多的因素會造成迴歸直線在座標上的截距改變, 像這種類似"平移"的變化, 對 r值並不會有太大的變化, 但是"平移" 前後所計算得到的濃度卻會有很大的差別.

4. 檢量線中需要多少點(濃度)?
一般至少五點!  其實點數是越多越好, 但是要考慮成本及分析時間的問題, 有些分析法會製作六點,容許你刪去其中的一點, 但是在這種狀況下, 最高和最低濃度是不能被刪除的!!

5.檢量線中"截距"的意義是甚麼?

      檢量線的每一個濃度經過儀器的分析後,都會產生一個相對應的訊號,假如我們忽視偵測極限的存在,從高到低一直到濃度為零的時候, 這條線應該是要經過座標的原點(0,0),在實際的狀況下卻絕少發生, 為甚麼會這樣? 因為還有儀器的噪音! 在重複製作檢量線時, 可以觀察到截距是會有變化的,在這個時候,除了儀器的噪音外,還要加上人為的操作誤差及不穩定度. 所以一位從事定量分析的新進人員, 初步的考驗就是令其重複製作檢量線, 由截距及斜率的變化, 可以很容易判斷出來該分析員一些基本操作, 例如標準品的稀釋是否熟練...........

      現在既然我們知道了截距所代表的意義,那麼截距與定量濃度之間又有甚麼樣的關係??    "假設"我們的人為操作的誤差為零,或經由多次的分析製作檢量線,所得到的平均"截距"事實上應該就可以代表儀器本身在分析時候所產生的噪音, 這種噪音的量化方式,可以取代人為主觀意識的測量,  例如製作噪訊比值(S/N ratio).在決定了噪音值的大小後,以S/N=3為例,最快的方法是直接在撿量線的Y軸上量取3a(a代表截距)的高度,此點訊號值的對應,即為分析物產生S/N=3所需之濃度. 另外,分析員可以藉由不同濃度的標準品注射,由分析物所產生的訊號(波峰面積或高度)與截距的比值,也可以直接得到產生S/N=3所需之濃度. 許多教科書上的說法都是由眼睛觀察出來, 並無數據上的支持,甲看是1:3, 由乙來看說不定變成1:4 !    尤其是氣相層析,低溫及高溫區域所得到的噪音是完全不一樣的.......

      另外,如果你的眼睛夠尖銳,會發現某些檢量線的低濃度部分會位於Y軸3a下方, 這些部分的直線雖能符合品管規定(如r=0.995),但定量結果一般都還是不予採用的!!  所以前面強調過,調整分析物濃度盡量不要讓 它們的訊號值落在撿量線的低濃度部分....

      有空閒的話,可以試試看另外一種"變形"的檢量線: 配製至少五個濃度高於IDL的一系列標準品, 每個濃度注射分析七次,求每一濃度產生訊號的標準偏差, 所得的七個值點在以濃度為X軸,訊號值為Y軸的座標上,並線性迴歸得一直線,此直線的截距假設為a,3a就是你這個分析之LOD, 10a就是LOQ!!  這也是眾多LOQ, LOD的製作方法中的一種.

好！非常好

好东西，顶！

不错啊，我把它们转换成简体的了，有需要的可以下载附件
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原文由 xmyichen 发表:
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简单的用Word转换为简体，恐怕有些专业术语对不上。

我想大家连英文的资料都要看，繁体的会有障碍？

谢谢茅茅姐，你真是个好老师。