主题：【资料】欧盟兽药检测方法（之十四）

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一道黑

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发表于：2008/11/28 07:19:59 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

高效薄层层析法（HPTLC）和GC-MS法测定动物及动物组织中甲状腺抑制物质的残留量
（EEC确证法
Thyreostats-Method for the Measurement of Residues of Thyreostatic Substances in Animals and Animal Tissues on the Basis of High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) and Gas Chromatography-Mass Spectrometry(GC-MS)
(EEC Cy1.9 Confirming Method)

1. 引言
欧共体国家禁止在食用性动物中使用甲状腺抑制药物，共同体国家规定进口或共同体国家内所生产的动物性食品中的甲状腺抑制药物的最大残留限量（MRL）为0。

2.应用范围
Sg 1.4筛选法描述了食品和动物样品中甲状腺抑制物质的定性实验。本方法是Sg 1.4法的扩展，用GC-MS加以确证。该方法适用于肉类，也适用于如动物器官、体液及其排泄物样品的测定。对硫脲嘧啶（2-TU）、甲基硫氧嘧啶（MTU）、丙硫氧嘧啶（PTU）的检测限是25μg/kg（L），苯硫氧嘧啶（PhTU）、甲巯咪唑（TAP）经汞化柱后回收率降低，故这两种化合物的检测限是100μg/kg（L）。

3. 参考资料
ISO标准78/2-1982标准制定出---第二部分：化学分析的标准物质
93/256/EEC 委员会决议，规定了使用激素或甲状腺抑制物质中残留物的测定方法。（OJ. No.L.118，14.4.93，pp64-74）
EEC工作文件VI/3186/84-EN，文件6.21 II-4 使用选择性汞化柱检测新鲜肉组织中甲状腺抑制物的分析方法
De Brabander, H.F. and Verbeke, R.（1984）,甲状腺抑制剂的测定 Proc. 30th Eur. Meat Res. Workers , Bristol , 387-388.
De Brabander, H.F., Batjoens, P. and Van Hoof, J.(1992), 甲状腺抑制剂的HPTLC测定和GC-MS确证. J. Planar Chrom . 5, 124-130

4. 定义
本测定方法检测的甲状腺抑制物质分别为：
硫脲嘧啶（2-TU）、甲基硫氧嘧啶（MTU）、丙硫氧嘧啶（PTU）、苯硫氧嘧啶（PhTU）、甲巯咪唑（TAP）。

5. 方法提要
本方法包括：
层析处理的4个步骤：
---动物组织样品的匀浆或用甲醇稀释动物体液样品
---样品上清液通过汞化的离子交换树脂色谱柱进行层析
---衍生化
---双向HPTLC分离和鉴别
确证鉴定的3个步骤：
---从HPTLC薄层板刮下样品斑点
---MSTFA衍生化
---GC-MS

6. 试剂
注：所有试剂均为AR级。
6.1—6.12 参见Sg 1.4中化学试剂及甲状腺抑制物质HPTLC净化处理。
6.13 衍生化试剂：N-甲基-N-三甲基硅基-三氟乙酰胺（MSTFA）。（Pierce，产品号No.70127或Machery-Nagel，Duren，德国）
6.14 甲状腺抑制物的混和标准品的制备（20ng/μL），转移该标准溶液10μL至自动进样器的样品瓶中并挥发至干，再与50μL MSTFA混合60℃加热15分钟。

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2008/11/28 7:20:33 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

7. 仪器设备
7.1—7.14 参见Sg 1.4中设备
7.15 GC-MS，带ITS40离子阱的质谱（Finnigan Mat，San Jose，CA，USA）
7.15.1 气相色谱柱为30m*0.25mm，内涂0.25μm的DB-5（J&W）。不分流进样，柱温为100℃，保持2分钟后以5℃/min程序升温至150℃，再以20℃/min程序升温至250℃并保持3分钟。（总程序升温时间为20分钟）。
7.15.2 正化学离子源质谱（反应气：丁烷），每秒扫描一次，扫描时间20分钟，扫描范围m/z90-400（灯丝电压：倍增电压，延迟600秒）
7.15.3 扫描所得痕量甲状腺抑制物峰的保留时间和碎片离子见表1。
7.15.4 工作站
7.15.5 打印机
7.15.6 自动进样器（100μL）
上列公司及产品仅供参考，相当试剂，试验材料及设备同样可采用。
表1.
药品 RT（min）离子1 离子2 离子3（MH+）
TAP 13.2 171 186 259
TU 13.4 257 273 345
MTU 14.3 271 287 359
DMTU 15.2 285 301 373
PTU 15.6 299 315 387

8. 样品及取样程序
8.1 样品属性：样品应符合64/433/EEC指令中的定义及要求，关于进行肉中兽药的残留对样品的要求。如果肉中未检测其残留，可用动物的体液或排泄物作为样品来进行检测。
8.2 样品量：其数量必须满足本实验要求，必要时须满足复验所需的量。
8.3 样品的传递与包装须满足实验室能正确识别的要求。
8.4 包装、保存、运输的方法必须保持样品的完整性并不致产生检验结果的偏差。分析甲状腺抑制物的样品的保存与运输须在-18℃以下。

9. 测定步骤
9.1—9.14 参见Sg 1.4的实验过程
9.15 小心刮下薄层板上含有药物的斑点并转移至自动进样器小瓶中（7.16），加入25μL MSTFA混匀，加热该进样器小瓶至100℃并保持15分钟。在硅胶沉淀后取1-2μL上清液进行GC-MS分析。
9.16 GC-MS分析1μL标准品混合溶液（6.14）。

10. 结果计算
10.1 定性鉴别
对未知化合物的定性鉴别须同时采用比较其标准品的GC保留时间及MS的图谱来进行鉴别。
10.2. 回收率
经汞化柱后甲状腺抑制物TU、MTU、PTU、DMTU的回收率>78%，而PhTU为17%，TAP 60%。
添加至肉、血浆、奶中的内标、DMTU的回收率见表2
表2. 100μg/kg DMTU的添加回收率
样品检测的结果±SD（μg/kg）
PTU MTU TU
肉 106±5.5 102±13.7 97±21.8
血浆 84±6.2 98±5.0 76±5.7
奶 88±6.9 105±3.6 85±8.0
GC-MS法测定的回收率尚未确定。
10.2 精密度
10.2.1 重现性：按添加浓度100μg/kg加入至肉样品中，对方法每一测定步骤进行精密度试验，其重现性测定结果见Sg 1.4的表3。结果为De Brabander、Verbeke、GhenT所提供。

11．-15。
略

16. 检验流程图
动物组织加入甲醇与内标物匀质汞化柱渗滤

衍生化 HPTLC 荧光检测（366nm）

刮下薄层板上的待测物斑点 TMS衍生化

GC-MS 结果计算

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