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液质联用（LCMS）

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主题：【第六届原创】Q-TOF照妖，着色饮料那儿跑！

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lvdongming

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发表于：2012/08/04 21:24:46 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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Q-TOF照妖，着色饮料那儿跑﹗

且说正当奥运健儿龙腾虎跃熊奔，摘金揽银夺铜之际，五届原创大赛开幕了。奥运食品检测，2008，北京，哎呀（东北音）！时间长了不说，距离远了；世博会，2010，上海，忙来些（沪音）！倒是做过好些特供食品检测。奥运卫士也好，世博卫兵也罢，都是为了保障咱地球人的健康么，你说对不对喔（川音）？现在，老孙有了Q-TOF这面照妖镜，违规的着色饮品等等，嗨嗨，有想做的吗? 有敢做的么？有胆买的嘛?

1 实验部分

1.1仪器与材料
Agilent Technologies 6530 Accurate-mass Q-TOF LC/MS,
色谱柱：CNW.Athena UHPLC C18 2.1mm×100mm.1.8um. ANPEL,P/N LAEO-2110uA
固相萃取柱：迪马ProElut PLS 500mg/6mL
标样：柠檬黄，苋菜红，胭脂红，日落黄，诱惑红，亮蓝，靛蓝，新红，赤藓红，偶氮玉红，国家标准物质中心。酸性橙Ⅱ，酸性嫩黄G，酸性大红G,酸性大红GR,偶氮玉红，酸性黑10B，专利蓝V，碱性嫩黄O，碱性品红，碱性品绿，碱性橙Ⅱ，碱性桃红T，碱性玫瑰精，工业品，青岛川林染料工业有限公司等。
氨水，甲酸（LC-MS）
超纯水发生机：美国Millipore,电导≥18MΩ挠洀嬀/font]
固相萃取仪：Biotage AB Rapidtrace SPE

1.2标样配制：柠檬黄，苋菜红，胭脂红，日落黄，诱惑红，亮蓝六种常见色素分别配成5,2,1,0.5ug/L,供定量做标准曲线，其它均配成2ug/L供定性测定用
1.3样品制备
1.3.1活化：用5mL甲醇活化，5mL水平衡，弃去滤液。
1.3.2上样：将待净化样品约1mL加入小柱，弃去滤液。
1.3.3淋洗：加5mL2%甲酸水溶液，弃去滤液，将小柱抽干。
1.3.4洗脱：加4mL2%氨水/甲醇溶液洗脱，收集流出液，用2%氨水/甲醇溶液调至中性。
1.3.5重新溶解：用旋转蒸发仪于40℃减压蒸馏近干，用50%甲醇水溶液溶解并定容至1mL.

1.4液相色谱分离条件
流动相：A:0.02mol/L乙酸铵溶液(LC-MS),用超纯水配制，B:甲醇（LC-MS）
梯度洗脱条件：

流速：0.4mL/min

1.5质谱条件
经优化的质谱条件如下：Gas Temp :300℃,Drying Gas :8L/min,Nebulizer :45psig,SheathGas Temp :350℃, SheathGasFlow:11L/min, Vap:4000V, Capillary:0.059Ua, Frag:175V, Skimmer:65V, OCT .IRFV_pp:750V. Esi Vcap 4000V Capillary :0.447uA,Chamber :16.37uA Nozzbe Voltage:1000V
1.6六种常见限用合成色素提取离子图如下：
保留时间从前至后依次为：柠檬黄，苋菜红，胭脂红，日落黄，诱惑红，亮蓝。

图一：

1.7六种常见限用合成色素线性回归方程，相关系数，检测限，加标回收率如下表
表一：

2 结果与讨论
2.1 二十二种合成色素的基本信息如下表
表二：

2.2二十二种合成色素的离子模式，目标母离子，丢失特点，子离子，碰撞能量如下表
表三：

2.3谱图解析
柠檬黄和酸性嫩黄G同属吡唑啉酮类合成色素，柠檬黄在环上有羧基，较小的碰撞能量（10V）就能脱羧释出CO2，接着同时发生吡唑啉酮环的开裂（C-C,N-C键）和N-C键环合^【²^】，生成大量子离子，酸性嫩黄G则无羧基而相对稳定，在稍高碰撞能量（15V）少量解离出SO3，与柠檬黄相似同时发生吡唑啉酮环的开裂环合，有同样需中等及以上碰撞能量解离出SO3的合成色素还有：苋菜红，日落黄，诱惑红，亮蓝，靛蓝，新红，偶氮玉红，专利蓝V,酸性黑10B。
胭脂红与苋菜红为一对同分异构体，为双萘类色素，胭脂红不像苋菜红那样能够解离出SO3，它结构不稳，在较小的碰撞能量（15V）就能够开环解离出HSO3CHCH2，这是由于其二个磺酸取代基位于萘环同侧，使萘环上的电子云偏向，从而使萘环更易断裂开环，结构的不均衡同时也容易在偶氮双键两侧同时发生断裂脱去N2，剩余部分接合形成子离子；苋菜红结构非常均衡稳定，在较高的碰撞能量（30V）下，除解离出少量SO3外，能够使偶氮键发生断裂，形成相应子离子。
与胭脂红双磺酸基位于萘环一侧相同的情形也出现在色素酸性大红GR上，但酸性大红GR为双偶氮苯-萘色素，偶氮双键更多与苯环共轭，靠近萘环的偶氮侧链仅需10V就会较多断裂。而同为双偶氮苯-萘色素的酸性黑10B，由于萘环位于中间，电子云向中间集中，由于其中一个苯环带有亚硝酸取代基，造成苯环电子云向亚硝基偏移，从而使靠近亚硝基取代苯侧的偶氮侧链暴露而更易断裂，在中等碰撞能量下（25V），亚硝基取代的苯环同时开裂形成少量子离子，同时也有少量偶氮侧链在靠近萘环侧断裂脱去N2。偶氮玉红也为双萘类合成色素，但其萘环上均只有一个磺酸取代基，只是位置有差异，结构相对稳定，在中等碰撞能量下脱去一，二个磺酸基,释放SO3，从子离子丰度看，偶氮间位磺酸基较易丢失，在此基础上，偶氮侧链在纯萘环处更易断裂，形成相应子离子.
新红和酸性大红G同为苯-萘型色素，二者结构类似，但新红在苯环上多一个磺酸钠取代基，电子云分布更均衡，需较高碰撞能量（30V）才会使靠近萘环的偶氮侧链大量断裂，而酸性大红G，由于苯上无磺酸等取代基，电子云均衡性稍差，需中等碰撞能量就可达到同样效果。
日落黄和诱惑红也同为苯萘型色素，二者结构也相近，在解离出SO3的同时，均在靠近萘环的偶氮侧链处断裂，同时脱H2O形成子离子，诱惑红由于苯环多一甲基和甲氧基，正电性基团的存在使其在负离子模式和相同碰撞能量下母离子的解离稍少。赤藓红与碱性玫瑰精（罗丹明B）同属氧杂蒽类合成色素，结构比较稳定，在高碰撞能量（40V）下，赤藓红脱去苯环上的羧基及碘化氢生成子离子，碱性玫瑰精则更稳定，需要更高的碰撞能量（42V）才能解离出一，二个HNCH2CH3离子，而非羧基的CO2，这可从解离离子的精确质量上进行分辨。亮蓝，专利蓝V，碱性品红，碱性品绿（孔雀石绿）同属三芳甲烷类合成色素，结构比较稳定，碱性品红需高碰撞能量（40V）可脱出NH2及NH2CH3，同时发生甲烷键断裂形成子离子，专利蓝V，需中等稍小能量（20V）使苯环断裂，这也是由于二个磺酸取代基位于同一苯环，电子云偏心引起不稳定，使苯环更易开裂，在此同时甲烷靠近双磺酸取代苯侧发生断裂形成子离子，而亮蓝结构稳定需极高能量（50V）才解离出少量SO3，碱性品绿也需高碰撞能量（40V）脱去CH3CH3，并同时使甲烷键开裂（在靠近N甲基取代苯侧）形成子离子。
酸性橙Ⅱ，结构简单稳定的单磺酸基取代苯-萘色素，需中等碰撞能量（25V），可导致偶氮侧链沿磺酸基取代苯侧断裂形成子离子.碱性橙Ⅱ，结构简单的苯-苯类偶氮色素，在正离子模式下稍小碰撞能量（20V）就可脱NH3，同时发生偶氮键断裂形成子离子，但母离子总体响应值与其它碱性色素比稍低（无正电性的甲基等存在），在负离子模式下，则脱氢形成母离子，同时形成的碎片离子也不同（不发生偶氮键断裂）。碱性嫩黄O，属于二苯甲烷类色素，M+H为母离子，在较高碰撞能量（30V）脱出CH4，同时发生甲烷键断裂大量形成子离子。碱性桃红T,属吡嗪类色素，结构非常稳定，需用高的碰撞能量（40V），脱去CH3CH3，同时吡嗪环裂开，大量生成子离子。酸性嫩黄G，在负离子模式下检测灵敏度很低，这是由于在其吡唑啉酮环上存在正电性的甲基。在正离子模式下，灵敏度同样偏低，整个分子接近电中性，要提高灵敏度需考虑用其它电离方式检测。

2.4一些常见丢失及碎片分子（离子）的精确质量见下表：

表四：

通过对市场上销售的20中常见饮料进行检测，除二例检出少量柠檬黄，一例检出少量亮蓝外，（均在允许添加范围内）暂未检出其它种类合成色素。

参考文献：

［1］关淑霞，俞志刚，于海南，宋春红，宋增强 1-苯基 3-甲基-吡唑啉酮-5电喷雾质谱裂解途径的研究［J］，化学研究与应用,2010,22(9),1166-1169
［2］倪蓉，杨龙彪，刘兰侠，固相萃取-高效液相色谱法测定饮料中8种色素［J］中国卫生检验杂志，2010,20（5），991-992
［3］刘敏，李小林，别玮等固相萃取-高效液相色谱法同时测定调味品中15种工业合成染料［J］色谱，2011,29（2）162-167

该帖子作者被版主 chy57589893加 5积分， 2经验，加分理由：感谢

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2012/8/4 21:37:30 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

这个对我的帮助太大了，学习学习在学习

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dark_wzy

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2012/8/5 7:35:30 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

线性系数都能做出1，回收率均在80%以上？？这个结果貌似有点不可思议!

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arvid2007

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2012/8/5 10:01:09 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

楼主很强大啊，做得这么详细，都可以去发表成文章了

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happy爱米粒

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2012/8/5 12:11:22 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

感谢分享，楼主排版有些问题，方便传个附件吗？我帮你修改一下版面

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阿怪

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2012/8/6 8:10:27 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

柠檬黄的分子式应该是C16 H9 N4 O9 S2 Na3，楼主少了N4，分子量是对的，，目标母离子如果是[M-3Na+2H]-的话，应该是465.9895？而楼主是467.0043？目标母离子和目标子离子之间的丢失，数值是43.976，此处放-3Na+2H是不是不太合适？应该是丢失CO2，丢失CO2理论值应该是43.9898，与楼主的相比，误差有29ppm，是仪器没校正还是？还有QTOF做线性，楼主线性范围做到了多少啊？

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