主题：【第六届原创】“正版仪器+盗版方法”打造更强测试方法（发光菌）

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光谱发表于：2013/08/31 15:25:15 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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“正版仪器+盗版方法”打造更强测试方法（发光菌）

摘要：本文从发光菌急性毒性测试方法的原理出发，分析了现行国标方法的缺陷，并深入比较了国外主流仪器的优缺点。进而总结出一套可靠性更高的急性毒性测试方法。方法涵盖实验分析、干扰分析、数据处理、质量控制等方面。同时，针对现有方法研究中的不足，提出了建立青海弧菌Q67毒性数据库及真和发光菌研发两个方向。为发光菌急性毒性测试方法新国标的修制定提供了参考。

☆ 正版仪器：checklight水质毒性分析仪

☆“盗版”方法：结合国标、文献及多种国外方法后的集合版

发光菌急性毒性测试在水环境应急中是比较常用的仪器，它不仅能指示被测水体的毒性强弱，还能间接反映某种未知污染物（或已知物质，但暂无检测方法的）的相对浓度。与其他生物急性毒性测试方法相比，以发光菌为受试生物的测试方法的最大优势在于其耗时较短（仅需15min），此外其还兼具操作简便、仪器便携等优点，在国内外环境应急监测中广泛应用。

从分析方法上看，国内外以发光菌为受试生物的急性毒性测试方法很多，中国国内也有发光菌急性毒性测试方法。除GB/T 15441-1995外，其他方法多与需要配套专门的仪器。下面，我们从测试方法的共性与其差异上探讨国标的不足，并初步讨论改进后测试方法的优越性

1 共性分析——基本测试原理

几个方法有一个共同点，就是其基本测试原理保持一致。即：

细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸及长链脂肪醛氧化为及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为490nm处的蓝绿光。

式中，是黄素单核苷酸还原型；FMN是其氧化型；RCHO是长链脂肪醛（C8以上）；RCOOH是由醛氧化而成的相应脂肪酸；hv代表光子（最大发射波长490nm）

当发光细菌接触有毒污染物时,细菌新陈代谢则受到影响,发光强度减弱或熄灭,发光细菌发光强度变化可用发光检测仪测定出来。在一定浓度范围内,有毒物浓度大小与发光细菌光强度变化成一定比例关系,因此可通过发光细菌来监测环境中的有毒污染物。

图1 有毒物质抑制发光机理

☆抑制发光机理：①直接抑制参与发光反应的酶类活性；②抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程。

2 差异性分析——方法深入剖析

2.1 国标方法GB/T 15441-1995

中国对于发光菌的研究起步较晚，1995年才颁布以发光菌为受试生物的急性毒性测试国标方法。从理论上说该方法应该集各家所长，充分吸收国外对于此方法研究的优点，但使用过该方法的人都知道，国标方法还是存在着4个不足之处。

其一是仅对每管菌的荧光强度放入计算公式，未对空白样品的荧光强度进行计算分析，而实际分析中受发光菌质量及环境条件的影响，空白往往也有一定偏离，不将空白引入计算公式将产生较大的测试偏差；

其二是许多非毒性因子的影响未被放入干扰分析中。如营养盐、浊度等；

其三是测试的受试生物为明亮发光杆菌，由于国内外对该菌的毒性测试数据较少，没有毒性数据库支持。

其四是对于数据的质量控制，目前在标准上提及的较少。

2.2 国外方法及仪器

现行国标存在不足之处，那是否可以直接套用国外的方法呢？

下面对市场上主流的仪器checklight水质毒性分析仪与美国SDI的DeltaTox发光细菌毒性检测仪测试方法及其分析方法进行差异性分析。

图2 checklight水质毒性分析仪

图3美国SDI的DeltaTox发光细菌毒性检测仪

美国SDI的DeltaTox发光细菌毒性检测仪测试方法是一个比较经典的分析方法，得到EPA的认可，通过几代的改进，已经较为成熟。它以蒸馏水空白为对照对样品进行分析计算，解决了国标中的第一个漏洞。同时DeltaTox以费氏弧菌为受试生物，通过大量实验数据，建立了涵盖众多化合物毒性数据的toxbase数据库，使得数据的科学性和支撑性得到了强大的保障。显然，该方法较现行国标要科学且实用。不过方法仍未对非毒性因子的影响进行分析，对于数据质量控制方面的描述较少。此外，DeltaTox发光细菌毒性检测仪仪器本身存在着开放性不强的缺点，即仅能使用规定方法进行分析，用户得到的只是相对值，无过程数据。这使得在测试初期无法获取菌液初始荧光值数据，不能很好地实现对于菌液初始活性的控制（若初始活性很低，说明发光菌活化不完全或已经失去活性，后续测试结果将毫无意义）

checklight水质毒性分析仪另辟蹊径，通过添加屏蔽剂，在指出水样毒性的同时，将污染物进行了初步分类。但从毒性分析角度看，由于引入了新的物质，其测试结果必将受到较大的影响。此外该方法也不能完全指示水样的污染类型（有机污染or无机污染），如六价铬，按照方法的测试步骤显示为有机毒性，与事实不符。从仪器角度看，该仪器属于开放性的分析仪器，用户可以将其作为荧光计使用，从而可以控制菌液的初始活性。

综上所述，以上方法均存在一定的缺点。为使监测数据更科学，需要对其进行优化。

3 发光菌急性毒性测试方法的优化

3.1 测试仪器的选择

发光菌急性毒性测试基于荧光强度分析，所以首先我们需要一台荧光强度计。通过上述分析，可以看到美国SDI的DeltaTox发光细菌毒性检测仪属于专用仪器，由于用户不能更改其过程，所以在方法优化时只能弃用。checklight水质毒性分析仪虽然方法上看对测试结果均值较大影响，但作为开放式仪器，完全能被用作其他发光菌急性毒性方法的分析。为节省开支，也可以使用国产仪器，只要选择能测试荧光强度的仪器，且灵敏度高就能用

3.2 测试方法的优化

作为国人，还是支持国货吧。我们以国标方法GB/T 15441-1995为模板进行修改，只要解决了数据计算、非毒性因子的影响、毒性数据库支持这三个问题，测试结果的科学性就会得到极大的提高。在此基础上，我们可以再加入数据的质控措施，以消除一些操作失误及未知影响带来的偏差，得到更为可靠的结果。

3.2.1 受试生物的选择

先把受试生物选择提上来说，因为它是整个测试的基础。目前，研究和实际监测中最常用的发光菌有费氏弧菌（V．Fischeri）、明亮发光杆菌T3（photobacterium phosphoreum-T3）和青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensis sp-Q67)。其中费氏弧菌是国际流行的Microtox test中使用的推荐菌株；明亮发光杆菌T3是GB/T15441-1995中推荐的菌种，与费氏弧菌类似，都来自海洋，测试需要高渗环境；青海弧菌Q67是我国华东师范大学朱文杰等分离得到的淡水发光菌，其摆脱了Na+依赖，从而不需要维持高渗的测试环境。

在实际应急监测中，经常会遇到感潮性河流监测，这类河流盐度较高，不适合青海弧菌等淡水菌株生长；且环境突发性环境污染事故发生时，局部水体可能发生盐度增高，渗透压变大的问题，使用青海弧菌Q67容易出现假阳性。所以为增大方法的适用范围，应急监测时，建议使用海洋发光菌菌株。此外，从文献研究上来看，费氏弧菌的研究较明亮发光杆菌更多，也更为深入，且有美国toxbase支持，所以建议选择海洋发光菌费氏弧菌为受试生物。

图4 常用发光菌——明亮发光杆菌

图5 常用发光菌——费氏弧菌

图6 常用发光菌——青海弧菌

3.2.2 基本操作及计算过程

取出储存在-20 ℃下的冻干细菌，立即加入0.3ml稀释液让细菌水合。 20分钟后，摇匀，用Tox-screen Ⅱ毒性分析仪测定菌液原始发光强度，记为I0。取出0.1ml,测定菌液发光强度，记为I1(用于对照的记为I1’)；加入0.9ml经渗透压调解的水样（对照为纯水），反应5min后，测定菌液发光强度，记为I2（对照为I2’）。水样毒性的变化用相对抑制率表示，当样品中存在刺激发光物质时，相对抑制率以正值表示：各处理段水样毒性的变化用相对抑制率表示，当样品中存在刺激发光物质时，相对抑制率以负值表示。

★注：这里的药剂投放量未做深入研究，如有不妥，还可以继续优化。这里只提供了一种可以得到较为可靠数据的方法。

3.2.3 非毒性因子对测试的影响

确定了受试生物，就可以针对性地研究分析方法的影响因子了。对于非毒性因子的影响，在《发光菌毒性测试的影响因子研究》一文中已对影响因子作了一定的探讨，这里不再赘述。仅把结果贴出。

①使用费舍尔弧菌测定水样生物综合毒性时，温度必须控制在10~25℃；

②水样pH超过4~10范围时，测定结果显示出一定毒性作用；

③浊度低于425时，浊度对发光菌的发光未发现有显著抑制作用；

④当水样中存在一定量的有毒物质时，水体中营养物质所带来的生长刺激作用几乎消失，仅表现为生长抑制作用。

★注：不同菌种的影响因子范围可能有显著差异，不能把Vibrio fischeri的影响因子结果直接套用在其他菌种上。

3.2.4 数据的质量控制

测试数据的质量控制手段是数据科学性的保障。使用Vibrio fischeri急性毒性测试方法时，对非毒性因子进行的影响分析在一定程度上避免了测试结果假阳性。不过要提高Vibrio fischeri急性毒性测试的可靠性和可重现性，还必须对方法加入合适的质量控制措施。

在《发光菌急性毒性测试的质量控制研究》一文中，我们通过对大量的实验数据的统计分析，探讨了一些较为实用的质控手段。

数据分析的结果显示：为使测试结果有更高的重现性，菌液初始发光强度应大于500000；实验空白光损率应保持在50%±10%范围内；1.07mg/L的Zn2+溶液阳性对照质控样应该控制在51%±11%范围内。

★注1：不同菌种的数据控制范围可能有显著差异，不能把Vibrio fischeri的研究结果直接套用在其他菌种上。

注2：这里提一下，在使用质控样的时候，我们使用了Zn2+溶液阳性对照质控样，而没使用汞盐。因为汞盐属于高毒性物质，容易对操作人员造成伤害，操作不当还可能对环境造成二次污染。

4 展望

4.1 青海弧菌Q67毒性数据库的研发

青海弧菌Q67也是一个比较好用的发光菌，由于不外加NaCl，其测试毒性更接近真实细胞毒性。因此在盐度不大的水体中，有着较费氏弧菌更为优越的应用价值。不过由于目前国内外还未完全建立青海弧菌Q67的毒性数据库，在应用该菌作为受试生物时，其支撑性科研数据还有待研究。

4.2 真核发光菌的研发

发光细菌法作为一种原核生物的试验方法，由于原核生物自身的特点也不可避免含有一些缺陷。比如原核细胞对于毒性物质的耐受性较真核细胞高，再者某些化合物要表现出毒性就必须经过真核生物体内复杂的代谢活化，而原核生物确实这些代谢系统。

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