主题：【第八届原创】黄柏叶分析条件的摸索

黄柏叶分析条件的摸索

材料

主要仪器
安捷伦高效液相色谱仪,恒温水浴锅（上海）,超声仪(昆山市超声波仪器有限公司)。
主要试剂
盐酸小檗碱对照品购自中国药品生物制品检定所,磷酸二氢钾,甲醇（色谱纯）,乙睛(色
谱纯),盐酸。
药材来源
样品从黑龙江采尚志地区采集。
方法
流动相的筛选及其色谱条件的建立
参考黄连中盐酸小檗碱含量测定的常用流动相为乙睛一磷酸二氢钾,本实验通过比较3种不同比例的乙睛一0.05mol/L的磷酸二氢钾流动相：乙睛：0.05mol/L磷酸二氢钾（60:40）、乙睛：0.05mol/L磷酸二氢钾（50:50）、乙睛：0.05mol/L磷酸二氢钾（40:60），对黄柏叶所含成分的分离情况,从中筛选出最佳流动相进行测定。最终,构建黄柏叶中盐酸小檗碱含量测定的色谱条件。
标准曲线绘制
精密吸取标准品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml分别置于100ml量瓶中,以盐酸：甲醇（1:100）定容至刻度。取配置的不同浓度的对照品溶液,进样10ul,以峰面积(Y)为纵坐标,进样浓度（X）为横坐标,绘制标准曲线。
方法学考察
精密度实验
精密取同一黄柏叶样品溶液10ul,按黄连色谱条件连续进样6次,记录峰面积。
稳定性实验
取同一黄连样品溶液,分别在0、1、2、4、12、24h精密进样10ul,照黄连色谱条件进
行测定,记录峰面积。
重复性实验
取同一黄柏叶样品药材粉末,制得6份样品溶液,分别精密进样10ul,照黄连色谱条件进
行测定,记录峰面积并计算含量。
回收率实验
取己知含量的黄柏叶药材粉末约50mg,加入对照品适量,按样品溶液制备方法制
备样溶液,照黄连色谱条件测定,计算平均样品加样回收率。
溶液的制备
对照品溶液配制  精密称取干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品,加甲醇溶解,制成每1ml含0.156mg的溶液,作为对照品溶液。
样品溶液的制备  取黄柏叶粉末约50mg,精密称定,置100ml量瓶中,加入盐酸:甲醇(1；100)50ml,60℃水浴中温浸10min,取出,超声处理30min,用盐酸:甲醇(1:100)定容至刻度,摇匀,以微孔滤膜滤过,取滤液作为样品溶液。
盐酸小檗碱提取条件的优化
本试验按照影响黄连中盐酸小檗碱提取率的三个主要因素固液比（A）、水浴时间(B)、
超声时间(C)设计了正交试验L934,实验因素设计见表。从中筛选出盐酸小檗碱的最优提取条件,并对上述三个主要因素按照对盐酸小檗碱提取率的影响程度进行主次排序。
结果
色谱条件的确定
流动相筛选结果
3种不同比例的流动相得出的同一样品黄柏叶图谱分别为图1、图2、图3。其
中,以图3中的hplc图谱中各峰分离情况最佳,即流动相C乙睛: 0.05mol/L磷酸二氢
钾(40:60)能够较好的分离黄柏叶中各成分。

                                      图1

                                            图2

                                          图3
色谱条件的建立
安捷伦色谱柱（4.6umX250mm,5um）,流动相为乙睛: 0.05mol/L磷酸二氢钾(40:60)
检测波长345nm,流速1.0ml/min,柱温25C,进样量10ul。
标准曲线绘制
结果表明,盐酸小檗碱在0.78-7.8ug/ml范围内含量与峰面积有较好的线性关系,
所得标准曲线为Y=29110X+7838.3(r=0.9995)。盐酸小檗碱标准曲线结果见下图;


方法学考察
精密度实验
实验结果表明见表,所取黄柏叶样品中盐酸小檗碱平均峰面积为355253
RSD为0.16%,表明所使用的高效液相色谱仪精密度良好。


重复性实验
实验结果表明见表,所取黄柏叶样品中盐酸小檗碱平均含量7.24%,RSD为1.3%
,表明该实验方法盐酸小檗碱提取方法重复性良好。

回收率实验
实验结果表明,所取黄柏叶样品中盐酸小檗碱平均回收率为99.27%,
RSD为0.32%。

盐酸小檗碱提取条件优化
从正交试验的结果可以看出,正交设计法得出各因素最优提取组合为A1B1C3,既固液比为0.05：100,水浴时间为10min,超声时间30min。处理组合的极差分别为固液比极差为0.520,水浴时间极差为0.107,超声时间为0.103。它们之间的关系为A>B>C,即影响因素A固液比对盐酸小檗碱提取率影响最大,其次是水浴时间,而超声时间对盐酸小檗碱的提取率因素最小。

讨论

采用hplc法测定黄柏叶中盐酸小檗碱含量中所采用的流动相主要为乙睛和磷酸二氢钾混合溶液,而不同比例乙睛一磷酸二氢钾混合溶液对黄连中各成分的分离效果亦有不同。磷酸二氢钾能够较好的消除小檗碱中碱性成分造成的拖尾现象,提高分离效果。本实验通过比较种不同比例的混合液流动相得出的图谱中,以流动相乙睛：磷酸二氢钾溶液（40:60）对黄柏叶中各成分的分离效果最好。
正交试验设计因其高效、快速的特点,一直以来被作为实验方法筛选的首选方法。本试验按照影响黄柏叶中盐酸小檗碱提取率的三个主要因素固液比、水浴时间、超声时间设计了正交试验,得到最优盐酸小璧碱提取组合为既固液比为0.05：100,水浴时间为10min,超声时间30min。在进行黄柏叶中盐酸小檗碱提取时,除了可以采用甲醇做溶剂,有文献报道乙醇同样可以提取黄柏叶中的盐酸小檗碱,但提取过程相对繁琐。本实验提取方法能够较好地提取盐酸小檗碱并且提取方法操作简便,为黄柏叶的有效成分含量研究、中药质量标准的建立等提供较好的物质基础。