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1、材料与仪器
罗汉果皂苷V对照品(来源:中国检验检疫局;批号:111754-200601;纯度:100%);乙腈(色谱纯,上海安普实验科技股份有限公司);一级水;磷酸(分析纯,广州化学试剂厂)、清咽含片(汤臣倍健股份有限公司)。
超声波清洗器(EQ-500,昆山市超声仪器有限公司);waters超高效
液相色谱仪(沃特世科技(上海)有限公司); 电子天平(感量0.1mg,
梅特勒-托利多科学仪器有限公司);色谱柱(C18,XSELECT HSS T3 2.5μm 2.1×100mm,沃特世科技(上海)有限公司)。
2、色谱条件
色谱柱(C18,XSELECT HSS T3 2.5μm 2.1×100mm);流速:0.4mL/min;柱温:40℃;进样量:5μL;检测波长:203nm,流动相:乙腈: 0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱,如下表:
时间(min) | 乙腈(%) | 0.1%磷酸水(%) |
0 | 18 | 82 |
1 | 18 | 82 |
5 | 27 | 73 |
7.5 | 27 | 73 |
7.6 | 18 | 82 |
10 | 18 | 82 |
3、标准品溶液的配制
精密称取罗汉果皂苷V对照品20.00 mg,置于25 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得罗汉果皂苷V对照品溶液,为储备液。分别精密吸取罗汉果皂苷V标准贮备液稀释成5个罗汉果皂苷V标准梯度使用液,浓度分别为0.033mg/mL、0.0504mg/mL、0.083mg/mL、0.166mg/mL、0.333mg/mL。
4、供试品溶液的配制
精密称取样品0.29g,置于25 mL棕色容量瓶中,加甲醇适量,于45℃超声30min,并不时振摇样品,放冷,用甲醇定容至刻度,摇匀,即得。
5、标准曲线的绘制
将标准系列溶液浓度为0.033mg/mL、0.0504mg/mL、0.083mg/mL、0.166mg/mL、0.333mg/mL的罗汉果皂苷V标准液进行UPLC分析,记录色谱图,以标准品的浓度为横坐标,标准品的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,求得回归方程。
6、检出限实验
将浓度为0.77 μg/mL的对照溶液进样测定,通过工作软件的计算得S/N=3。按实际样品的处理过程计算。
7、精密度实验
精密称取样品6份,按2.4供试品制备方法处理样品,检测样品含量,计算其RSD(%)。
8、回收率实验
精密称取约0.29g样品9份,置于25mL容量中,分成3组,每组3份,于每一组中分别精密加入罗汉果皂苷V标准使用液(浓度为0.8324 mg/mL) 1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL,加入适量的甲醇,45℃超声30min使溶解并定容至刻度,摇匀,经0.45μm的微孔滤膜过滤,即可。
9、 结果与讨论
9.1 标准曲线确证结果
测定罗汉果皂苷V的标准曲线见图1,其标准方程为Y= 2877896.2267X+2312.4018(r=1.0000),线性范围为0.033-0.333mg/mL。
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9.2 检出限和定量限
分析方法的检出限和定量限由信噪比(
S/N)计算。检出限定义为S/N=3时对应的待分析浓度,定量限定义为
S/N=10时对应的待分析浓度。
9.2.1 检出限 将浓度为0.77 μg/mL的对照溶液进样,通过工作软件的计算得S/N=3。按实际样品的处理过程计算,方法的检出限为:0.77μg/mL×25mL/0.29g= 66.4μg/g。
9.2.2 定量限 取信噪比=10:1定为检测浓度,DL=2.57 μg/mL,按照实际样品的处理过程计算,方法的定量限为: 2.57μg/mL×25mL/0.29g = 221.6μg/g。
9.3 精密度实验结果
罗汉果皂苷V的精密度结果见下表,6个样品的含量范围为0.4325~0.4471g/100g,平均含量0.44g/100g,相对标准偏差(RSD)为1.5%,表明该方法有良好的精密度。
序号 | 称样量(g) | 浓度 | 含量(g/100g) | 平均含量(g/100g) | RSD(%) |
(mg/mL) |
1 | 0.29263 | 0.05203 | 0.4445 | 0.44 | 1.5 |
2 | 0.29711 | 0.0516 | 0.4341 |
3 | 0.29574 | 0.05156 | 0.4358 |
4 | 0.29017 | 0.05021 | 0.4325 |
5 | 0.28762 | 0.05107 | 0.4439 |
6 | 0.28839 | 0.05158 | 0.4471 |
9.4 回收率实验结果
罗汉果皂苷V在3个不同添加水平下浓度的回收率结果见下表,3个浓度下样品中的罗汉果皂苷V的提取回收率范围是94.98%~100.83%,平均回收率为:97.6%,相对标准偏差(RSD)为1.8%。
序号 | 理论加 | 实测加标 | 回收率 | 平均 | RSD |
标量(mg) | 量(mg) | (%) | 回收率(%) | (%) |
1 | 1.33184 | 1.30079 | 97.668 | 97.58 | 1.8 |
2 | 1.33184 | 1.30239 | 97.788 |
3 | 1.33184 | 1.34284 | 100.826 |
4 | 1.6648 | 1.59282 | 95.676 |
5 | 1.6648 | 1.58125 | 94.981 |
6 | 1.6648 | 1.60273 | 96.271 |
7 | 1.99776 | 1.95674 | 97.947 |
8 | 1.99776 | 1.96715 | 98.467 |
9 | 1.99776 | 1.97061 | 98.641 |
9.5 测定条件讨论
经紫外扫描,罗汉果皂苷V在203nm处有最大的吸收,分析结果显示色谱图基线平稳,且各色谱峰峰形、分离度较好,所以选择了203nm作为检测波长。由于制剂配方成分的复杂,采用等度并不能很好的得到分离,因此试验所用的流动相是经过筛选得来,罗汉果皂苷V测定所用流动相是在普通
液相色谱条件的基础上进行梯度洗脱优化,经多次试验达到了良好的分离效果,且基线比较平稳,同时配合超高效色谱柱,检测时间短,适合本品的含量测定。