液相色谱-串联质谱法测定草鱼中硝基呋喃类代谢物AOZ残留量
摘要: 本文根据农业部783号公告-1-2006水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱－串联质谱法来检测草鱼中硝基呋喃类代谢物AOZ的残留。样品经水解、衍生化和净化后，采用多反应监测模式测定。通过化合物的保留时间、定性离子和定量离子的筛查与确证，实现对草鱼中硝基呋喃类代谢物AOZ的定性与定量。结果表明，其线性系数大于0.99，在2.5mg/kg和4.5mg/kg添加水平下，AOZ回收率在95%-100%之间，相对标准偏差(RSD)小于15%。
样品经水解、衍生化和净化后，以流动相A:0.002mol/L的醋酸铵溶液,B:甲醇进行梯度洗脱，C18(100mm×2.1mm，i.d,5um）色谱柱分离，采用正离子多反应监测( MＲM) 模式检测，基质匹配标准溶液定量。线性范围内相关系数均大于 0. 99。加标回收率在95.00%-100% 之间，相对标准偏差在6.19%- 8.43% 之间，结果表明，该方法简便、快速、灵敏度高、重现性好，可测定草鱼中硝基呋喃类代谢物AOZ的残留。
关键词: 高效液相色谱－串联质谱; 硝基呋喃代谢物AOZ; 草鱼；
Abstract:In this paper, AOZ residue of nitrofuran metabolites in grass carp was detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry according to the determination of nitrofuran metabolites residues in aquatic products in the ministry of agriculture no.783 bulletin 1-2006. After hydrolysis, derivatization and purification, the samples were determined by multi-reaction monitoring. AOZ, a nitrofuran metabolite in grass carp, was qualitatively and quantitatively determined by retention time, qualitative and quantitative ion screening. The results showed that the linear coefficient was greater than 0.99, the recovery of AOZ was between 95% and 100% and the relative standard deviation (RSD) was less than 15% at the addition levels of 2.5mg/kg and 4.5mg/kg.
After the samples were hydrolyzed, derivated and purified, the samples were separated by gradient elution in mobile phase A:0.002mol/L ammonium acetate solution,B: methanol, and separated by C18(100mm×2.1mm, i.d,5um) chromatographic column. Positive ion multireaction monitoring (MRM) mode was adopted for detection, and the matrix matched standard solution quantification. The correlation coefficients in the linear range are all greater than 0.99. The standard recovery was between 95.00% and 100%, and the relative standard deviation was between 6.19% and 8.43%.
Key words:ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；nitrofuran metabolites-AOZ;Grass carp.
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
液相色谱—质谱联用仪( 岛津LCMS-8030) ;
超纯水系统(WP-UP-YJ-20，沃特浦) ;
分析天平(Quintix 2102-1CN,赛多利斯公司)；
旋涡混合器（VORTEX 3，IKA公司）；
恒温水浴振荡器（江苏安普SHA-C)；
离心机（湖南湘仪H-2050R）；
甲醇(色谱纯，默克股份两合公司) ;
醋酸铵( 分析纯，天津市致远化学试剂有限公司)；
2-硝基苯甲醛（色谱纯，天津市百世化工有限公司）；
二甲基亚砜（分析纯，天津市百世化工有限公司）；
磷酸氢二钾（分析纯，天津市百世化工有限公司）；
乙酸乙酯（分析纯，天津市泰兴试剂厂）；
农药标准物质: 均来自农业部环境保护科研监测所（天津）；实验用水为经沃特浦超纯水系统处理后的超纯水。
1.2 样品处理
1.2.1 样品水解与衍生化
准确称取样品2.0g（精确至 0.01 g）到50 mL 离心管中，加入0.05mL的100ng/mL混合内标（AOZ-D₄），旋涡混合50s，再加入5mL盐酸溶液（0.2mol/L）和0.15mL的2-硝基苯甲醛溶液（0.05mol/L）,涡旋振荡50s后，置于恒温水浴振荡器中37℃避光震荡16h。
1.2.2 样品的提取净化
取出离心管冷却至室温，加入3-5mL磷酸氢二钾溶液（1.0mol/L），调节pH至7.0-7.5，加入4mL乙酸乙酯，涡旋振荡50s，4000r/min离心5min，取上层清液转移至10mL玻璃离心管中；再加入4mL乙酸乙酯重复上述操作，合并上清液于40℃下氮气吹干。加入1.0mL甲醇溶液（甲醇：水=5:95（V:V））涡旋振荡溶解残留物，过0.45um滤膜，待测。
1.2.3 溶液配制
（1）标准储备液。
分别取上述标准品（100.0 ug/mL 溶液），用甲醇稀释成 10 ng/mL 和100 ng/mL的标准储备液。
（2）标准工作溶液。
分别吸取上述标准品10ng/mL的标准储备液0.010mL、0.025mL、0.050mL、0.10mL和100ng/mL的标准储备液0.025mL、0.05mL、0.10mL于7个50mL离心管中，不加样品，按照1.2.1和1.2.2步骤操作，按照1.3测定。
1.3 色谱－质谱条件
1.3.1 色谱条件
色谱柱:C18柱，(100mm × 2.1mm，5μm ) ;
柱温为40℃；
进样量为20μL。
流动相：A.0.002mol/L的醋酸铵溶液,B:甲醇;色谱洗脱条件见表 1。

表 1 高效液相色谱梯度洗脱条件

时间，min	A,%	B,%	流速，mL.
3.5	15	85	0.25
5	15	85	0.25
5.1	76	24	0.25

1.3.2质谱条件
离子源: 电喷雾离子源ESI; 扫描模式为正离子扫描;雾化气流量3L/min；干燥气流量15L/min；加热块温度250℃；DL温度250℃；CID气230kPa；IG真空度1.9×10^-3pa；PG真空度7.5×10¹pa；检测方式为多重反应监测。其他质谱参数见表2。

表 2 反应监测的质谱采集参数

化合物	母离子m/z	子离子m/z	碰撞能量（v）
AOZ	236	104	19
AOZ	236	134*	22
AOZ-	240	134*	14
注：*为定量碎片离子

1.4 添加回收实验
准确称取不含上述药物的草鱼样品2.0g，分别以2.5mg/kg和4.5mg/kg2个水平进行添加回收实验，重复5次，按照上述实验方法测定，计算添加回收率和相对标准偏差。
2 结果与讨论
2.1线性回归方程
AOZ的基质标准曲线为 y = 0.217700 x -0.000564679
( r = 0.9969876，r²=0.9939843) ;如图3

图3（标准曲线AOZ）

2.2方法的准确度、精密度
在空白草鱼中分别进行 2.5和4.5 mg / kg 2 个水平的加标回收试验，每个水平重复测定 5 次，计算加标回收率和相对标准偏差。由表 5 可知，在 2.5和4.5mg / kg 2个添加水平下，AOZ的平均回收率分别为 99.648% 和95.63% ，相对标准偏差分别为 8.43% 和6.19%，方法显示出良好的准确度和精密度，可以满足试剂样品中农药残留的检测要求。

表 5 AOZ在草鱼中的回收率和相对标准偏差

农药	添加浓度( mg / kg)	平均回收率( %)	重复 1	重复 2	重复 3	重复 4	重复 5	平均值相对标准偏差( % )	标准曲线	相关系数r2
AOZ	2.5	99.648	2.517	2.261	2.663	2.723	2.292	8.43	Y=0.217700X-0.000564679	0.9939843
AOZ	4.5	95.63	4.223	4.768	4.043	3.870	4.613	6.19	Y=0.217700X-0.000564679	0.9939843

2.3实际样品分析
用本方法对市场销售的2份草鱼进行硝基呋喃类代谢物AOZ检测，均未检出,见图6。

图6

3、结论
本研究通过对样品前处理方法、质谱条件和色谱条件的优化，建立了液相色谱-串联质谱法测定草鱼中AOZ残留量的分析方法，该方法前处理简单、快速、回收率高，方法的灵敏度、准确度和精密度等均满足农药残留分析的要求，适用于大量样品的快速检测。
参考文献
高洁，朱莉萍等.超高效液相色谱-串联质谱法测定多脂肪类动物源性食品中硝基呋喃代谢物. 食品安全质量检测学报·2018年第9卷第6期，2018.

附件：

液相色谱-串联质谱法测定草鱼中硝基呋喃类代谢物AOZ残留量.doc