[摘要]目的优化改进QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）测定蜂蜜中11种喹诺酮类药物残留的方法。方法样品均质，冰乙酸-乙腈-水体系振荡提取后，加入DSC-18+PSA吸附剂，振荡提取后测定。结果各目标化合物在1.0μg/L-100.0μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数r均大于0.995。在3个添加水平的回收率为72.4%-104.2%，相对标准偏差为1.9%-8.1%。结论该方法快速，简便，准确，适合大批量测定蜂蜜中喹诺酮类药物残留。

[关键词] QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱法，蜂蜜，喹诺酮类药物

蜂蜜是昆虫蜜蜂从开花植物的花卉中采得的花蜜在蜂巢中酿制的蜜，可以止咳，调节神经系统，促进睡眠，提高免疫力，是生活中重要的天然食品。然而，近年来，一些蜜蜂养殖场为了追求较高的利益，在饲养蜜蜂时使用喹诺酮类抗生素来降低蜜蜂的发病率和死亡率。喹诺酮类药物是一类由萘啶酸发展起来的人工合成的含4-喹诺酮基本结构的广谱抗菌药，它具有价格低廉、广谱、高效、低毒等特点，被广泛应用于预防和治疗蜜蜂下痢病，但过量滥用会导致蜂蜜中抗生素残留问题严重，长期食用可致重症肌无力症状加重，呼吸肌无力而危及生命，且有潜在的致癌性和遗传毒性，对人体健康造成危害。因此，建立一种能够快速、准确测定蜂蜜中喹诺酮类药物残留的方法具有一定的必要性。

目前，蜂蜜中喹诺酮类药物的检测方法主要是液相色谱法，高效液相色谱法-质谱/质谱法，前处理大部分需要过HLB固相萃取柱，前处理周期长，效率低，不适合日常大批量检测工作的要求。本文通过实验，建立了快速测定蜂蜜中喹诺酮类药物的方法，该方法高效、准确、简便，适用于蜂蜜中喹诺酮类药物的大批量检测。

1.材料与方法

1.1仪器与试剂

TQ-S Waters高效液相色谱串联质谱仪(Waters 公司，美国）、C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司，美国）、多位试管涡旋振荡器（德国Heidolph Multi Reax）漩涡混匀器（SCILOGEX MX-S）；电子天平（感量0.001 g赛多利斯BT-223S）；

甲醇（色谱纯，美国Merck）、乙腈（色谱纯，美国Fisher），Discovery＠DSC-18吸附剂

冰乙酸-乙腈-水溶液：1mL冰乙酸、15mL水，均置于100mL量筒中，混匀后加入乙腈至100mL。

0.1%甲酸水溶液：准确量取100μL甲酸于100mL量筒中，加水定容至刻度。

喹诺酮类药物标准物质：氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、恩诺沙星、二氟沙星、奥索利酸、氟甲喹、单诺沙星、沙拉沙星（农业部环境保护科研监测所，201905）

1.2方法

1.2.1样品前处理

准确称取混匀后的蜂蜜样品2g（精确到0.01g）于50mL塑料离心管中，加入10mL含冰乙酸-乙腈-水溶液，立即涡旋振荡20min ，以免样品聚团或结块，8000r/min离心5min，取上清液6mL，加入已准确称取C18+PSA（200mg+75mg）吸附剂的15mL离心管中，涡旋振荡5min，8000r/min离心5min，取上清液1mL，加入1mL0.1%甲酸水溶液稀释后用于测定。

1.2.2 液相色谱条件

Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温：40℃，流速：0.2 mL，进样体积：5μL，流动相：A：40%甲醇-乙腈，B：0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序见表1。

表1 11中喹诺酮类药物的洗脱程序

时间	40%甲醇-乙腈（%）	0.1%甲酸水溶液（%）
0	10	90
1.2	16	84
3.0	16	84
4.2	35	65
5	80	20
6.5	100	0
7.0	100	0
7.5	10	90
8.0	10	90

1.2.3 质谱条件

电喷雾电离正离子模式（ESI+），采用多反应离子检测（MRM），毛细管电压 3.3kV离子源温度：150℃，脱溶剂气温度：500℃，脱溶剂气流量：700L/h，锥孔反吹气流量：150L/H。目标物质谱参数见表2

表2 11种喹诺酮类抗生素的主要质谱条件

化合物	保留时间（min）	母离子	子离子	碰撞能量（V）	锥孔电压
恩诺沙星	2.30	360.2	316.1* 245	25 20	32
诺氟沙星	2.13	320	271.1* 233	25 20	32
培氟沙星	2.15	334.1	316.1* 270.1	19 19	34
环丙沙星	2.19	332.1	314.1* 288.1	18 22	32
氧氟沙星	2.12	362.1	318.1* 261.1	25 20	32
沙拉沙星	2.70	386.2	342.1* 299.1	27 18	37
洛美沙星	2.34	352.1	265.2* 308.1	22 16	31
奥索利酸	3.46	262	244* 216	30 19	30
氟甲喹	4.52	262	244* 202	32 21	30
单诺沙星	2.30	358.2	314.1* 96.0	25 20	32
二氟沙星	2.70	400.2	356.1* 299	27 21	37

1.2.4标准溶液的配置

分别将11种喹诺酮类药物标准溶液（100μg/mL）用甲醇稀释，配成浓度为10μg/mL的标准储备液。再将11种标准储备液用甲醇稀释，配成1μg/mL混合标准使用液。

准确吸取混合标准使用液2μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL,用空白基质提取液定容至1mL，配置成2、5、10、20、50、100μg/L混合标准系列。在1.2.2和1.2.3的仪器条件下依次对标准空白、标准系列、样品空白、样品进行测定，以系列中各类化合物含量为横坐标，以其定量离子峰面积为纵坐标，得到标准曲线及回归方程，根据样品响应计算各目标化合物含量。

2.结果分析

2.1前处理方法的选择

目前对于喹诺酮类药物的净化多采用HLB固相萃取柱净化，但是该方法操作繁琐，耗时长，所以我们对现在应用比较广泛的QuEChERS技术进行了探索。由于喹诺酮类药物中大多含有可质子化的氮原子和可离解的羟基，呈现出酸性或碱性，所以选择含有冰乙酸的乙腈水溶液作为提取剂。

吸附剂的用量和种类对净化效果有直接影响，过量会吸附目标化合物，回收率降低，不足时吸附效果不佳，净化不完全，本实验考察不同质量C18、PSA、C18+PSA分散固相萃取粉末对100μg/Kg阴性加标样品回收率，结果显示使用C18净化时，质量为250mg有较好的回收率，5种化合物70.7%-127.5%之间，但有6种化合物回收率在小于65.7%，使用PSA净化时，质量为150mg有较好的回收率，5种化合物80.7%-131.2%之间，但有6种化合物回收率在小于45.7%，使用C18+PSA净化时，质量为200mg+75mg回收率范围80.6-107.5%，所以最终确定使用吸附剂C18+PSA（200mg+75mg）。

2.2 基质效应

用空白样品基质加标与纯溶剂标准评价基质效应，利用公式[17]计算基质效应（ME），(n=3)，A为空白基质配制的工作溶液，B为纯初始流动相配制的相同浓度的标准溶液，比值大于0为基质增强作用，比值小于0为基质抑制作用，|比值|≦20%可以认为受基质影响不显著，配置高中低（20、200、500μg/Kg）三种浓度的工作溶液及标准溶液，结果表明，不同11种化合物基质效应不同，强弱与目标化合物浓度也有关，其中二氟沙星（56.0~37.3%）、沙拉沙星（50.3%~27.4%）、奥索利酸（20.4%~19.5%）、氟甲喹（36.7%~24.3%）表现为基质增强作用，氧氟沙星（-32.3%~-21.7%）、培氟沙星（-30.3%~-17.7%）、诺氟沙星（-44.2%~-40.1%）、洛美沙星（-31.3%~-26.6%）、环丙沙星（-38.1%~-35.1%）、恩诺沙星（-30.5%~-27.4%）。表现为基质抑制作用，单诺沙星（－13.3%~7.8%），基质效应影响不显著。为准确测定各化合物含量，本实验采用基质匹配标准曲线进行校正。

2.3质谱条件的优化

质谱的锥孔电压、碰撞能量对11种喹诺酮类药物的裂解有重要影响。采用流动注射分析法对目标物单独进样，在正离子检测模式下进行一级质谱分析，得到最大响应值的母离子峰。在MS/MS模式下，找到该母离子对应的子离子，采用多反应检测模式（MRM）进行分析。11种喹诺酮类药物的优化质谱条件见表2.

2.4液相条件的优化

色谱条件主要是对流动相和梯度进行了优化。通过比较了甲醇、乙腈、水、0.1%甲酸作为流动相对各目标物的峰型及响应的影响。结果显示：选择乙腈-水作为流动相时各物质能够分离，峰型也不拖尾，而且大多数化合物在甲醇中有更强的响应，故有机相用40%甲醇-乙腈。在水相中加入0.1%甲酸可以提高离子化效率，改善峰型的对称性。所以最终确定流动相为40%甲醇-乙腈和 0.1%甲酸水溶液。针对11种化合物出峰时间，对梯度进行优化调整，优化后的梯度洗脱程序，使待测物尽可能性质相近的化合物得到有效分离。如图1

图1 1 1种喹诺酮类药物总离子流图

2.5线性范围、检出限和定量限

在本仪器条件下标准工作液进行测定，各目标化合物在2-100μg/L均有良好的线性关系，称取2g阴性样品加入10μL标准使用液，配置成5μg/Kg的加标样品，按本法处理测定，得到各化合物的平均信噪比S/N。以信噪比为3时所对应的浓度为本法检出限，以信噪比为10时所对应的浓度为本法定量限，结果见表3。

表3 11种喹诺酮类药物的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限

化合物	线性方程	相关系数(r)	检出限（μg/Kg）	定量限（μg/Kg）
恩诺沙星	Y=82018.5*X-18633.3	0.9963	2.0	6.0
诺氟沙星	Y=70183.7*X-19621.7	0.9961	2.0	6.0
培氟沙星	Y=78055.9*X-23284.3	0.9957	2.0	6.0
环丙沙星	Y=71254.6*X-26876.2	0.9964	2.0	6.0
氧氟沙星	Y=51001.3*X-12512.4	0.9973	2.0	6.0
沙拉沙星	Y=67581.1*X-11862.8	0.9977	1.0	3.0
洛美沙星	Y=86076.5*X-8133.87	0.9981	2.0	6.0
奥索利酸	Y=66252.9*X-17198.8	0.9971	1.0	3.0
氟甲喹	Y=67621.2*X-20909.4	0.9952	1.0	3.0
单诺沙星	Y=38875.6*X-11684.4	0.9991	2.0	6.0
二氟沙星	Y=78567.6*X-15286.1	0.9974	1.0	3.0

2.6回收率和精密度

取阴性样品加入适量标准工作液，分别进行50.0μg/Kg，200.0μg/Kg，500.0μg/Kg 3个添加水平的回收率和精密度实验，每个添加水平做6个平行实验，其平均回收率和精密度结果见表4,。从表中结果可知，回收率范围在72.4%-107.6%，相对标准偏差为1.9%-8.1%，重现性良好，符合分析要求。

表4 11种喹诺酮类药物的回收率和相对标准偏差

化合物	添加水平（5.0μg/Kg）		添加水平(10.0μg/Kg)		添加水平(20.0μg/Kg)
化合物	平均回收率（%）	相对标准偏差（%）	平均回收率（%）	相对标准偏差（%）	平均回收率（%）	相对标准偏差（%）
恩诺沙星	79.8	3.1	85.4	4.8	79.9	3.9
诺氟沙星	87.0	2.6	89.5	5.5	82.8	4.5
培氟沙星	90.6	1.9	84.3	6.7	80.9	6.1
环丙沙星	72.4	2.3	97.6	5.1	86.8	2.9
氧氟沙星	81.7	7.7	104.2	2.8	93.4	7.0
沙拉沙星	96.4	8.1	92.2	4.6	81.7	5.5
洛美沙星	102.5	4.5	80.2	6.7	85.2	4.1
奥索利酸	90.2	5.6	87.5	5.0	107.6	6.3
氟甲喹	85.4	3.9	79.3	3.4	93.8	7.2
单诺沙星	80.8	4.2	86.5	3.1	88.9	6.9
二氟沙星	75.3	7.8	78.7	5.9	90.6	6.4

2.7实际样品检测

应用本方法，对本地市场销售的35批次蜂蜜样品进行检测，诺氟沙星检出1份，结果为40.8μg/Kg，检出率为2.9%；环丙沙星检出1份，结果为8.2μg/Kg，检出率为2.9%，其余项目均未检出。

3.结论

本文优化改进QuEChERS-UPLC-MS/MS测定蜂蜜中11种喹诺酮类药物残留的方法，采用C18+PSA作为吸附净化剂，操作简单且，对蜂蜜基质有较好的净化效果和较好的回收率，优化的色谱条件，对11种化合物有较好的色谱分离，避免了共流出物对待测物的基质影响，甲醇乙腈混合流动相有利于提高喹诺酮类化合物在正离子模式下的响应，，研究对比了各化合物的基质效应，使用机制匹配曲线使操作简单，定性定量更加准确可靠，在1.0-100.0μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数r均大于0.995，回收率为72.4%-104.2%，相对标准偏差为1.9%-8.1%。本法适用于应于大批量快速测定蜂蜜中11种喹诺酮类药物残留工作的需要。