主题：【分享】【金秋计划】BCA定量后WB内参不齐的原因在这里！

常见原因：
（1）蛋白上样不均：在蛋白上样过程中，蛋白质浓度不均或上样量不一致是导致内参不齐的主要原因之一。
（2）转膜效率不均：蛋白从胶到膜的转移效率不同，尤其是高分子量蛋白和低分子量蛋白的转移效率差异明显，导致内参蛋白信号的不一致。
（3）膜的处理不当：尼龙膜和PVDF膜在处理过程中，若洗膜不彻底或封闭不完全，会导致背景噪音增加，从而影响内参蛋白信号的均一性。
（4）抗体孵育不均：一抗和二抗的孵育不均，或抗体浓度不合适，均可能导致内参蛋白信号出现不均现象。
（5）蛋白发生降解：样本储存不当或处理过程中蛋白酶活性未被抑制，会导致内参蛋白部分降解，影响WB检测结果。
解决办法：
（1）确保上样量一致性。①定期校准移液器，确保每孔上样量的准确性。②预先进行BCA定量，标准曲线的R方值一定要在0.99以上。③确保每个样本孔中加样体积一致，常规做法是上样20-30μL，但具体体积可根据实际需求调整。
（2）优化转膜条件。①根据目标蛋白的分子量选择合适的转膜条件，对于高分子量蛋白（>100 kDa），建议延长转膜时间或提高转膜电压，例如将转膜时间延长至2 h或将电压提高至30V；对于低分子量蛋白（<30 kDa），可以缩短转膜时间至30 min或降低电压至15V。②使用合适的转膜液，常用的转膜液包括Tris-Glycine缓冲液和转膜缓冲液（如10%甲醇、0.02% SDS）。③确保转膜系统的均一性，使用均匀的电场和温度条件进行转膜，保证全程加冰低温，避免局部过热导致转膜效率不均。
（3）正确处理膜。①使用合适的封闭和洗膜条件，使用合适的封闭液（如5%脱脂奶粉、5% BSA），确保封闭时间不少于1h。使用合适的洗膜液（如TBST或PBST），确保彻底去除未结合的抗体和其他杂质，建议每次洗膜时间不少于5 min，共洗3-5次。②确保膜的均一处理，在封闭和抗体孵育过程中，确保膜完全浸在溶液中。
（4）加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。①细胞裂解后，加入适量的蛋白酶抑制剂（如PMSF），防止蛋白不断降解。②蛋白样品应尽量在-20°C下进行保存，减少蛋白降解。③ 蛋白样品制备过程中，尽量缩短处理时间，避免长时间暴露在常温条件下，减少蛋白降解。