冬凌草乙素(Ponicidin)是从中药冬凌草(Rabdosia rubescens)中提取的二萜类化合物,具有免疫调节、抗炎、抗病毒和抗癌等多种活性。尽管冬凌草乙素对多种恶性肿瘤有疗效,但其与肝细胞癌(HCC)相关的确切功能和作用机制仍然未知。冬凌草乙素体外显著抑制肝癌细胞增殖和迁移,体内抑制肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡。机制上,冬凌草乙素靶向Keap1(E3泛素连接酶)并促进Keap1-PGAM5复合物形成,介导PGAM5的泛素化降解。此外,冬凌草乙素通过PGAM5激活半胱氨酸依赖性线粒体通路,导致线粒体损伤和ROS产生,从而促进肝癌细胞线粒体凋亡。
1、冬凌草乙素抑制HCC细胞的增殖和迁移
作者首先通过体外实验发现能以剂量依赖性方式有效抑制HepG2细胞的增殖和迁移。为了确定冬凌草乙素的靶标,作者合成生物素标记的冬凌草乙素(Bio-Ponicidin)开展Pulldown实验,通过质谱鉴定Keap1蛋白(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1,E3泛素连接酶的底物识别亚单位)为冬凌草乙素的可能靶标。
2、PGAM5在HCC组织样本中上调接着,作者利用TCGA数据库发现Keap1高表达与HCC患者较低的生存率有关,并利用HCC组织芯片发现肝癌组织中Keap1的表达高于癌旁组织,结果表明Keap1在HCC发病机制中具有潜在作用。Keap1蛋白是一种重要的调节蛋白,可以通过与其他蛋白质相互作用来调节细胞内信号通路,于是作者通过文献检索发现PGAM5是一种与Keap1互作的重要蛋白质,且前面的Pulldown实验也显示PGAM5被拉下。TCGA数据库分析显示PGAM5高表达与HCC存活率较低相关,组织芯片显示HCC组织中的PGAM5表达高于癌旁组织,且与较高的病理分级相关,结果表明PGAM5同样在HCC发病机制中具有潜在作用。进一步作者通过人类蛋白质组微阵列检测冬凌草乙素的直接靶蛋白,发现冬凌草乙素与Keap1直接结合而不与PGAM5蛋白结合,结果表明冬凌草乙素可能直接与Keap1结合并影响PGAM5,从而在HCC中发挥药理作用。
3、Keap1和PGAM5相互作用的结构基础Keap1可以与PGAM5结合,然而,它们结合的结构基础尚不清楚。为了观察Keap1与PGAM5结合过程的动态变化,作者通过分子动力学模拟发现Keap1-PGAM5复合物的结构总体上保持稳定,且PGAM5上的Val78、Glu79、Ser80和Glu83氨基酸与Keap1的Kelch结构域相互作用。采用AlphaFold3算法来预测 Keap1-PGAM5 的相互作用,发现复合物的总体预测折叠与真实结构相似。
4、Keap1-PGAM5配合物中晶体整体结构及相互作用的洞察分析为了更好地理解Keap1和PGAM5相互作用的分子机制,作者进行了结构生物学实验。通过晶体学实验获得了Keap1-PGAM5配合物的结构,分析得到两者的结合模式和结合位点,并通过蛋白点突变后的ITC实验发现Glu79是Kelch与PGAM5结合的关键残基。进一步作者通过SPR、CETSA、Co-IP、EMSA等实验验证冬凌草乙素和Keap1的Kelch结构域结合,而不能和Keap1的?54-PGAM5(54-289号氨基酸)突变蛋白结合。考虑到Keap1是一种E3连接酶,促进蛋白质的泛素化和降解。作者发现冬凌草乙素可以增加PGAM5的泛素化,增加Keap1-PGAM5蛋白共定位,表明冬凌草乙素可以与Keap1结合,从而促进Keap1与PGAM5的互作,促进PGAM5的泛素化。
5、冬凌草乙素影响Keap1的Kelch结构域的变构来稳定Keap1与PGAM5结合进一步通过分子对接模拟发现冬凌草乙素可以与Keap1的Kelch结构域稳定结合,而不是PGAM5。此外,Keap1-PGAM5复合物与Ponicidin结合后更稳定。冬凌草乙素的结合影响了Kelch结构域的变构模式变化,抑制了PGAM5的不稳定运动。总之,冬凌草乙素可以影响Kelch结构域的变构并促进Keap1和PGAM5的结合稳定性。
6、冬凌草乙素促进Keap1与PGAM5互作口袋的收紧稳定Keap1-PGAM5复合物冬凌草乙素促进Keap1-PGAM5复合物的形成,作者进一步研究Keap1-PGAM5结合冬凌草乙素后相互作用口袋的变化,发现Keap1-PGAM5复合物在冬凌草乙素结合后具有更强的能量,且改变了Keap1-PGAM5复合物的构象分布。结果表明冬凌草乙素的结合加强了Keap与PGAM5之间的结合。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]
7、冬凌草乙素通过PGAM5相关通路促进线粒体凋亡有研究报道PGAM5可以通过与Bcl-xL相互作用参与细胞凋亡,作者推测冬凌草乙素可能通过PGAM5的泛素化在细胞凋亡中发挥作用。结果显示冬凌草乙素可以通过调节Bcl-2家族中的凋亡蛋白来触发HepG2细胞凋亡。作者进一步研究冬凌草乙素对线粒体的影响,发现冬凌草乙素治疗激活了半胱天冬酶依赖性线粒体通路,导致HepG2细胞中的线粒体损伤和ROS产生。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]
8、冬凌草乙素在体内可促进HCC细胞凋亡抑制肿瘤生长最后,作者对BALB/c裸鼠进行了异种移植实验,发现冬凌草乙素治疗后肿瘤体积显著减少,肿瘤组织中凋亡相关蛋白上调,增殖相关蛋白下调。此外,PGAM5在HCC组织中高度表达,而冬凌草乙素降低其蛋白质水平。这些发现表明冬凌草乙素可以降低PGAM5水平,诱导凋亡,并抑制HepG2细胞增殖。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]
总结天然产物冬凌草乙素靶向Keap1并促进Keap1-PGAM5复合物的形成,导致PGAM5的泛素化和降解。此外,冬凌草乙素通过PGAM5激活半胱氨酸依赖性线粒体通路,导致线粒体损伤和ROS产生,从而促进 HepG2 细胞中的线粒体凋亡。这些结果基于涉及Keap1-PGAM5复合物的机制为冬凌草乙素的抗HCC特性提供了见解。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]
冬凌草乙素(Ponicidin)是从中药冬凌草(Rabdosia rubescens)中提取的二萜类化合物,具有免疫调节、抗炎、抗病毒和抗癌等多种活性。尽管冬凌草乙素对多种恶性肿瘤有疗效,但其与肝细胞癌(HCC)相关的确切功能和作用机制仍然未知。冬凌草乙素体外显著抑制肝癌细胞增殖和迁移,体内抑制肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡。机制上,冬凌草乙素靶向Keap1(E3泛素连接酶)并促进Keap1-PGAM5复合物形成,介导PGAM5的泛素化降解。此外,冬凌草乙素通过PGAM5激活半胱氨酸依赖性线粒体通路,导致线粒体损伤和ROS产生,从而促进肝癌细胞线粒体凋亡。
1、冬凌草乙素抑制HCC细胞的增殖和迁移暂无留言
作者首先通过体外实验发现能以剂量依赖性方式有效抑制HepG2细胞的增殖和迁移。为了确定冬凌草乙素的靶标,作者合成生物素标记的冬凌草乙素(Bio-Ponicidin)开展Pulldown实验,通过质谱鉴定Keap1蛋白(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1,E3泛素连接酶的底物识别亚单位)为冬凌草乙素的可能靶标。
2、PGAM5在HCC组织样本中上调接着,作者利用TCGA数据库发现Keap1高表达与HCC患者较低的生存率有关,并利用HCC组织芯片发现肝癌组织中Keap1的表达高于癌旁组织,结果表明Keap1在HCC发病机制中具有潜在作用。Keap1蛋白是一种重要的调节蛋白,可以通过与其他蛋白质相互作用来调节细胞内信号通路,于是作者通过文献检索发现PGAM5是一种与Keap1互作的重要蛋白质,且前面的Pulldown实验也显示PGAM5被拉下。TCGA数据库分析显示PGAM5高表达与HCC存活率较低相关,组织芯片显示HCC组织中的PGAM5表达高于癌旁组织,且与较高的病理分级相关,结果表明PGAM5同样在HCC发病机制中具有潜在作用。进一步作者通过人类蛋白质组微阵列检测冬凌草乙素的直接靶蛋白,发现冬凌草乙素与Keap1直接结合而不与PGAM5蛋白结合,结果表明冬凌草乙素可能直接与Keap1结合并影响PGAM5,从而在HCC中发挥药理作用。
3、Keap1和PGAM5相互作用的结构基础Keap1可以与PGAM5结合,然而,它们结合的结构基础尚不清楚。为了观察Keap1与PGAM5结合过程的动态变化,作者通过分子动力学模拟发现Keap1-PGAM5复合物的结构总体上保持稳定,且PGAM5上的Val78、Glu79、Ser80和Glu83氨基酸与Keap1的Kelch结构域相互作用。采用AlphaFold3算法来预测 Keap1-PGAM5 的相互作用,发现复合物的总体预测折叠与真实结构相似。
4、Keap1-PGAM5配合物中晶体整体结构及相互作用的洞察分析为了更好地理解Keap1和PGAM5相互作用的分子机制,作者进行了结构生物学实验。通过晶体学实验获得了Keap1-PGAM5配合物的结构,分析得到两者的结合模式和结合位点,并通过蛋白点突变后的ITC实验发现Glu79是Kelch与PGAM5结合的关键残基。进一步作者通过SPR、CETSA、Co-IP、EMSA等实验验证冬凌草乙素和Keap1的Kelch结构域结合,而不能和Keap1的?54-PGAM5(54-289号氨基酸)突变蛋白结合。考虑到Keap1是一种E3连接酶,促进蛋白质的泛素化和降解。作者发现冬凌草乙素可以增加PGAM5的泛素化,增加Keap1-PGAM5蛋白共定位,表明冬凌草乙素可以与Keap1结合,从而促进Keap1与PGAM5的互作,促进PGAM5的泛素化。
5、冬凌草乙素影响Keap1的Kelch结构域的变构来稳定Keap1与PGAM5结合进一步通过分子对接模拟发现冬凌草乙素可以与Keap1的Kelch结构域稳定结合,而不是PGAM5。此外,Keap1-PGAM5复合物与Ponicidin结合后更稳定。冬凌草乙素的结合影响了Kelch结构域的变构模式变化,抑制了PGAM5的不稳定运动。总之,冬凌草乙素可以影响Kelch结构域的变构并促进Keap1和PGAM5的结合稳定性。
6、冬凌草乙素促进Keap1与PGAM5互作口袋的收紧稳定Keap1-PGAM5复合物冬凌草乙素促进Keap1-PGAM5复合物的形成,作者进一步研究Keap1-PGAM5结合冬凌草乙素后相互作用口袋的变化,发现Keap1-PGAM5复合物在冬凌草乙素结合后具有更强的能量,且改变了Keap1-PGAM5复合物的构象分布。结果表明冬凌草乙素的结合加强了Keap与PGAM5之间的结合。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]
7、冬凌草乙素通过PGAM5相关通路促进线粒体凋亡有研究报道PGAM5可以通过与Bcl-xL相互作用参与细胞凋亡,作者推测冬凌草乙素可能通过PGAM5的泛素化在细胞凋亡中发挥作用。结果显示冬凌草乙素可以通过调节Bcl-2家族中的凋亡蛋白来触发HepG2细胞凋亡。作者进一步研究冬凌草乙素对线粒体的影响,发现冬凌草乙素治疗激活了半胱天冬酶依赖性线粒体通路,导致HepG2细胞中的线粒体损伤和ROS产生。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]
8、冬凌草乙素在体内可促进HCC细胞凋亡抑制肿瘤生长最后,作者对BALB/c裸鼠进行了异种移植实验,发现冬凌草乙素治疗后肿瘤体积显著减少,肿瘤组织中凋亡相关蛋白上调,增殖相关蛋白下调。此外,PGAM5在HCC组织中高度表达,而冬凌草乙素降低其蛋白质水平。这些发现表明冬凌草乙素可以降低PGAM5水平,诱导凋亡,并抑制HepG2细胞增殖。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]
总结天然产物冬凌草乙素靶向Keap1并促进Keap1-PGAM5复合物的形成,导致PGAM5的泛素化和降解。此外,冬凌草乙素通过PGAM5激活半胱氨酸依赖性线粒体通路,导致线粒体损伤和ROS产生,从而促进 HepG2 细胞中的线粒体凋亡。这些结果基于涉及Keap1-PGAM5复合物的机制为冬凌草乙素的抗HCC特性提供了见解。[img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img]