尿中黄曲霉毒素代谢产物的高效
液相色谱测定法
卫生毒理学杂志 2000年第4期第14卷 方法研究
作者:孙桂菊 贺霞 钱耕荪 浦跃朴 金锡鹏 王加生
单位:孙桂菊(东南大学医学院营养与食品卫生系,南京 210009 上海医科大学公共卫生学院);贺霞(Johns Hopkins University School of Hygiene and Public Health );钱耕荪(上海市肿瘤研究所);浦跃朴(东南大学医学院营养与食品卫生系,南京 210009);金锡鹏(上海医科大学公共卫生学院);王加生(Texas Tech University Institute of Environmental and Human Health)
黄曲霉毒素(AF)是一类毒性和致癌性很强的化合物,为第一类人类致癌物[1] ,是人类原发性肝癌的主要致病因素之一[2~4],其中毒性和致癌性最强的为AFB1,进入机体后除形成AFM1、AFP1等外,也可被活化为AFB1-8,9-环氧化物,攻击DNA形成AFB1-N7-鸟苷(AFB-N7-GUA), 可经尿液排出,攻击蛋白质形成AFB1-白蛋白加合物而残留于血液中[5]。机体中II相代谢酶如谷胱甘肽转硫酶(GSTs)可使谷胱甘肽与AFB1-8,9-环氧化物结合,终以AFB-硫醇尿酸(AFB-NAC)的形式经尿排出[6],许多化学物质可影响机体I相与II相代谢酶的活性,进而改变AF代谢产物的排泄类型,所以测定尿中AF不同代谢产物的排出,不仅可评价机体的暴露水平也可为研究化学预防的机制提供科学依据。过去对人体尿中AF的排出的研究主要集中在AFM1[7,8],测定方法有薄层层析、酶联免疫及高效
液相色谱法(HPLC)等[2,9]。作者在美国Johns Hopkins University公共卫生学院环境卫生系进修期间对单克隆抗体亲和层析柱结合HPLC同时检测尿中多种AF代谢产物的方法学进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料 AFM1、AFB1、AFP1为SIGMA公司产品,AFB-N7-GUA 和AFB-NAC为所在实验室合成。其他所用试剂均为美国可购得最高纯度级产品。HPLC检测系统为Hawlett packed 1 040 A型紫外分光(UV)检测器并联Dynmax FL-2型荧光检测器(激发波长366 nm,发射波长436 nm)。HPLC柱为C185 μm(4×250 mm)的Microsorb反相分析柱(Rainin,Inst. Co.生产); LCQ高效
液相-质谱仪(LC/MC,Thermoquest Co)。
1.2 方法 人体尿样的收集:样品为所在实验室与我国的两项合作研究所采样品,采自广西扶绥县和江苏启东县两肝癌高发区成年居民。尿样为连续两天清晨收集12 h的整夜尿,分装出150 ml(50 ml×3)冰冻,空运至美国,-80 ℃冰冻保存。
HPLC检测系统条件设置:HPLC检测系统流动相为5mmol三乙醇甲酸铵(TEAF)水溶液和无水乙醇,色谱分离采用梯度分离,25 min之内乙醇比例从体积分数为10%上升至25%,流速为1 ml/min,柱温50 ℃,检测限AFM1为10 pg,AFB-NAC和AFB1为50 pg,AFP1和AFB-N7-GUA为0.5 ng。配制标准系列进行HPLC分析,AFP1、AFB-N7-GUA按UV峰面积定量,AFM1、AFB-NAC和AFB1按荧光峰面积定量,用峰面积和标准浓度求得标准曲线。以样品色谱图对应标准物保留时间洗脱峰面积通过标准曲线定量。
测定方法:免疫亲和柱树脂的成分为2 B11、2F5和IIA4 B3 3种单抗的树脂混合物,比例为2∶2∶1,其制备过程见已发表文献[10~13]。免疫亲和柱对AF代谢产物结合能力、方法的回收率测定及尿中AF生物标记物的测定方法流程按图1所示。
尿中所测AF代谢产物的确正:收集HPLC各标准物保留时间段的洗脱液,经过浓缩柱、甲醇洗脱,高纯氩气浓缩至50 μl后,用LC/MS对AF代谢产物进行结构分析确证[6],LC流动相为5 μmolTEAF、体积分数为100%的甲醇和体积分数为100%的乙腈,分离梯度为开始的4%乙腈/2%甲醇,25 min内上升为13%乙腈/12%甲醇。质谱仪检测范围为200~600 m/z,碰撞能为25%和30%。
2 结果
2.1 尿中黄曲霉毒素生物标记物的HPLC分离及紫外和荧光图谱 所测5种生物标记物混合标准经HPLC分离后的紫外和荧光光谱见图2,AFP1和AFB-N7-GUA的荧光较弱,而AFM1、AFB1、AFB1-NAC则适于荧光分析。
结合能力=过免疫亲合柱标准物的峰面积/未过柱峰面积*100%;表中数据为4~6次试验的±s;a:混合标准100 ng指5种标准物的量分别为20 ng,混合标准200 ng?指5种标准物的量分别为40 ng
2.2 免疫亲和层析柱对AF代谢产物结合能力 如表1所示免疫亲和层析柱对单一标准物的结合能力较强,容量为1 ml的免疫亲合柱可结合高达100~200 ng的单一AF标准,该剂量超过尿样中AF含量的100~1 000倍,进一步证明采用1 ml的免疫亲合柱测定尿中AF生物标记物是适宜的。用混合标准物时亲合柱对尿中AF结合能力依次为AFM1≈AFB1≈AFP1>AFB1-NAC>AFB1-N7-GUA, 说明不同的AF代谢产物之间存在竞争性结合。
2.3 方法回收率 方法回收率试验表明随着加标量的不同其回收率有一定的变化,尿中主要的代谢物AFM1的研究表明,500 pg以下可达到全部回收,剂量增至5~10 ng回收率尽管有所下降,但仍可达80%左右(表2),说明该方法的回收率是可以接受的。其他AF代谢物的回收率见表2。
2.4 人群尿样中AF代谢产物的测定 用本方法对采自广西扶绥和江苏启东的76份尿样进行了AF生物标记物的测定,如表3所示,扶绥居民尿中的AF代谢产物含量显著高于启东居民(P<0.01), 88.9%(24/27)的扶绥居民尿样中可检出AFM1和AFB-NAC,AFB-N7-GUA和AFP1的检出率较低,分别为37.0%(10/27, 0.390±0.141 ng/mg肌酐)和29.6%(7/27, 0.194±0.044 ng/mg肌酐),而AFB1则未检出。启东居民尿样中AFP1、AFB-N7-GUA和AFB1未检出。
2.5 尿中AFM1和AFB1-NAC的确证 收集尿样HPLC分析AFM1和AFB1-NAC保留时间段的洗脱液, LC/MS图谱(未列出)可以看到质/荷比(m/z)=329.2的AFM1分子标准特征离子,碰撞反应后可以见到m/z=329.2离子失去一个CO+基团后的m/z=301.2离子,及再失去一个CO+基团的m/z=273.3离子; 另外也有m/z=492的AFB-NAC分子标准特征离子,离子碰撞反应后可见失去N-乙酰半胱氨酸后的离子m/z=329.1。
a:表中数据为6次试验的+s,b:尿样先经OASIS去除杂质后进行测定的结果