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微量凯氏（Kjeldahl）定氮法是国标法，测蛋白质只能用它。

原文由 lijuan9730 发表:
微量凯氏（Kjeldahl）定氮法是国标法，测蛋白质只能用它。

三聚氰胺事件后，其它的检测方法越来越受人们重视

Folin-酚法　　Folin—酚试剂法（Lowry法）
　　（一）实验原理
　　这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。
　　Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
　　进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。
　　此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
　　此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。
　　（二）试剂与器材
　　1.试剂
　　（1）试剂甲：
　　（A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。
　　（B） 0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。
　　（2）试剂乙：
　　在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
　　（3）标准蛋白质溶液:
　　精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。
　　2. 器材
　　（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）秒表 （4）试管16支
　　（三）操作方法
　　1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。
　　注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。
　　进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。
　　2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。
　　根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。
　　注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。
　　Folin-酚法测定蛋白质含量
　　原理：磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应．蛋白质中含有代酚基的酪氨酸，故有此反应．Folin---酚法的灵敏度是双缩脲法的100倍．
　　试剂：一：１，4%碳酸钠；2，0.2N氢氧化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。1和2等体积混合，3和4等体积混合，然后将两液以50：1混合(甲)。当天使用。二：1NFolin--酚试剂(乙)。
　　方法：标准曲线；试管中加0、0.2、0.40、0.60、1.00毫升酪蛋白溶液（500微克/毫升），加水补足１毫升，平行做两份。按序各加５毫升试剂（甲），摇匀，室温置放１０分钟，再依次加入１N（0.5毫升）Folin----酚试剂（乙），摇匀，30摄氏度保温３０分钟。然后在分光光度机上比色测定（A500）。待测样品如上反应和测定，对照标准曲线，得出含量。
　　注意：酚和柠檬酸对测定有干扰，低浓度尿素，胍，硫酸钠，硝酸钠，三氯乙烯，乙醇，乙醚，丙酮对显色无影响。

摘要：本研究以20种常见的饲料原料和2种化学标准物为试验材料，分别采用凯氏法和杜马斯燃烧法测定各饲料样本中的含氮量，并将其中11种样本分别送往3个实验室进行凯氏法和杜马斯燃烧法的测定，分析误差来源，以确立一种快速无污染的饲料含氮量测定方法。结果表明，两种测定方法呈显著线性相关（r=0.9998，P<0.001），而且大部分蛋白质饲料和能量饲料的含氮量测定值间没有差异（P>0.05）,变异系数（CV）<5%，但在测定羊草、小麦秸、玉米秸和稻草时，两种方法的测定值间存在显著差异（P<0.05，CV<5%）。在3个不同的实验室使用凯氏法测定时，7种样本间存在显著差异（P<0.05），其中2种样本的CV大于5%；而使用燃烧法时，只有2种样本存在显著差异（P<0.05），并且所有样本的实验室间CV均小于5%。11种饲料样本在3个不同实验室间测定值的平均CV值表现为燃烧法明显小于（P<0.01）凯氏法。结论：杜马斯燃烧法可以作为测定动物饲料和饲粮含氮量的常规方法。



杜马斯燃烧法与凯氏法测定饲料含氮量的比较研究

摘要 作者对比了凯氏定氮法与杜马斯定氮法的特点，用两种方法分别检测24种植物样品的氮含量，并对两种方法的测得结果进行了比较，发现杜马斯法测定的全氮总是略高于凯氏定氮法的结果，其原因是凯氏法不便检测硝态氮，所以认为杜马斯定氮法更适用于植物样品全氮的测定。

用凯氏法和杜马斯法测定植物样品中的全氮

蛋白质的测定是食物营养成分分析的必测项目，国家食品卫生标准也对部分食品中蛋白质的含量作了相应规定。测定食品中蛋白质的方法有许多种。凯氏定氮法这种测定蛋白质的经典方法，在实际工作中运用非常广泛，也是国家食品卫生标准检验方法中蛋白质测定的第一法。本文对凯氏定氮法测定乳及乳制品中蛋白质时应注意的事项与同行们交流如下。


乳及乳制品中蛋白质测定应注意的事项探讨

摘 要测定农产品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马斯然烧定氮法所代替，对比了杜马斯燃烧定氮法与凯氏定氮法的特点，介绍了杜马斯定氮法的原理及其在国内外农产品领域中的应用。


杜马斯燃烧定氮法在农产品品质检测中的应用

采用凯氏定氮法测定消毒牛奶中蛋白质的含量，其测量不确定度来源于样品称量、消化、定容、蒸馏、稀释标准溶液及滴定等过程。通过对各个不确定度分量的计算合成，找出影响测量不确定度的因素，并对各个不确定度分量进行评估，最终给出样品中蛋白质含量的标准不确定度及扩展不确定度。


凯氏定氮法测定牛奶中蛋白质的不确定度分析

用凯氏定氮法测定样品中总氮含量时，消化时间的长短会直接影响检测结果。我们在检测脑蛋白水解物注射液的总氮时根据不同的消化时间设计了一套对比试验，结果表明消化时间40min左右时最理想，时间过长或过短都会使检测值偏低。

消化时间对总氮测定结果的影响

蛋白质样品消化是奶粉样品检测的关键环节，国标法采用凯氏定氮瓶消化样品，取样量、试剂消耗量均较大，所需时间长(1个样品近5 h)，消化过程产生的酸雾对周围环境污染严重。本文采用测砷瓶加回流管在电热板上砂浴消化样品，可减少取样量，克服凯氏定氮瓶样品消化的不足，精密度与准确度均符合要求
奶粉中蛋白质样品消化方法的改进