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主题：【第三届原创参赛】HPLC法测定头孢曲松钠聚合物（7月份）【该作品已被《分析试验室》杂志接收】

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小卢

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发表于：2010/07/09 19:06:57 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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维权声明：本文为luxw(小卢)原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

恭喜luxw本作品被《分析试验室》杂志收录，接收在《分析试验室》2010年12月刊上发表

HPLC法测定头孢曲松钠聚合物

摘要：
目的：建立测定头孢曲松钠聚合物测定的高效液相色谱方法，并寻找减少样品分析时间的方法。方法：采用安捷伦1100高效液相色谱仪、不锈钢色谱柱（填料：Sephadex G-10，尺寸：10.0mm×300mm）、进样量100ul、检测波长254nm、流速1.5ml/min，在不同的流动相A和B中分析，并寻找梯度洗脱的比例来减少基线稳定时间。结果：方法满足检测要求，得到减少样品分析时间的梯度洗脱方法。
关键词：
聚合物、高效液相、谱图、基线、梯度洗脱
正文：
β-内酰胺类抗生素高分子杂质（中国药典称为“聚合物”，本文亦称聚合物）是引起临床过敏反应的一种杂质，往往是在生产、储存中降解得到或变大。为了保证临床用药安全，必须严格控制其含量，中国药典2010版也加大了对此类药品的聚合物检测。
头孢曲松钠为头孢类无菌原料药，其聚合物是杂质检测中重要的一项。在以往的实验中，一般采用高分子杂质仪进行测定其含量，仪器一般是由泵、检测器、数据处理器、色谱柱等在实验室组合而成，其柱为内径1.0-1.4cm的玻璃柱，填料为葡聚糖凝胶G-10，溶于水后在常压环境下手动填装而成。此仪器组装不方便，对其进行3Q验证困难，对国外认证来说比较困难。而仪器本身采用手动进样、色谱柱用前填装，因此实验过程繁琐、样品运行时间较长。为了适应国外验证的需要、减少样品分析时间，现采用高效液相色谱仪和高压填装的不锈钢色谱柱进行测定。
1 色谱条件：
仪器：agilent1100
色谱柱：Sephadex G-10， 10.0mm×300mm
流动相：A：pH7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液， B：水
流速：1.5ml/min
波长：254nm
进样量：100ul
2 系统适应性：
2.1蓝色葡聚糖2000在流动相A、B中的理论塔板数应大于400，拖尾因子小于应2.0，两种流动相中保留时间比应在0.93-1.07之间；
2.2对照液主峰和供试品溶液中聚合物峰与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰保留时间的比值均应在0.93-1.07之间；
2.3系统配制溶液测得高聚体的峰高与单体与高聚体之间的谷高比应大于2.0；
2.4对照品连续进样5次，峰面积的RSD应不大于5.0%

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2010/7/9 19:07:18 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

3 实验过程
3.1样品检测分析
3.1.1首先用流动相B，检测蓝色葡聚糖2000、对照品溶液；然后换流动相A检测蓝色葡聚糖2000、系统配制溶液、样品溶液。进样品溶液前，应该先保证系统适应性要求的项目合格。
系统走流动相B（水），当基线平稳后，
3.1.1.1进蓝色葡聚糖2000（浓度：0.5mg/ml）100ul，得数据：理论塔板数： 594 拖尾因子： 0.849
图谱如下：

3.1.1.2进对照品溶液（浓度约：0.1mg/ml），称取对照品（1）：26.27mg溶于250ml水中，进样3针；对照品（2）：24.94mg溶于250ml水中，进样2针，通过峰面积计算校正因子，得数据：平均值：1.0165×10-3 RSD为0.2%
计算对照液主峰与蓝色葡聚糖2000峰保留时间的比值，由图谱可得如下数据：
对照品1-1：6.464/6.632=0.97
对照品1-2：6.468/6.632=0.98
对照品1-3：6.464/6.632=0.97
对照品2-1：6.460/6.632=0.97
对照品2-2：6.460/6.632=0.97
图谱如下：

3.1.2更换流动相A（pH7.0缓冲盐），冲洗色谱柱约30min-60min，基线平稳后，
3.1.2.1进蓝色葡聚糖2000（浓度：0.5mg/ml）100ul，得数据：理论塔板数：1142 拖尾因子：1.503
两种流动相中蓝色葡聚糖2000的保留时间比为： 6.551/6.632=0.99
图谱如下：

3.1.2.2进系统适应性溶液（浓度：20mg/ml的0.4mg/ml的蓝色葡聚糖2000溶液）100ul，得数据：
高聚体的峰高与单体与高聚体之间的谷高比：594/45=13.2
图谱如下：（为了计算方面，下图为上图放大后计算谷高比的图谱）

3.1.2.3进供试品溶液100ul（浓度约：20mg/ml，称取某公司头孢曲松钠原料药0.2043g至10ml量瓶），通过校正因子计算聚合物含量，得数据：
聚合物%=校正因子*供试品峰面积*10/供试品称样量/250/1000*100%=0.2%
供试品溶液中聚合物峰与蓝色葡聚糖2000峰保留时间的比值：6.649/6.551=1.01
图谱如下：

3.1.3小结：从以上谱图和数据可以看出该色谱系统符合实验条件，所得数据有效，agilent1100液相色谱仪和高压填充色谱柱可以满足头孢曲松聚合物的检测。总结数据，通过表格形式列出后，如下：

该帖子作者被版主 rachelbj加 10积分， 2经验，加分理由：实验过程非常详尽

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2010/7/29 8:07:18 Last edit by luxw

小卢

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2010/7/9 19:07:49 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

3.2寻找梯度洗脱方法
从3.1项方法分析，此液相系统适合头孢曲松钠聚合物的测定，但从系统配制溶液和供试品溶液峰来看，基线平稳运行时间较长，增加了分析时间。现在就寻找一种减少基线平稳的洗脱办法。
一般情况下，加快分析时间的方法为增加流速或调整流动相比例。而此系统流速为1.5 ml/min，如增加流速则仪器压力增加很高，对柱子和仪器的损害比较大，因此决定从流动相A和B比例上来分析。在3.1.2.3项方法中，在100%磷酸盐缓冲系统中，供试品保留时间约为82min；在3.1.2.2项方法中，系统适应性溶液保留时间约为100min。聚合物出峰时间约为6.6min，因此在样品运行10min后调整流动相A和B的比例。
3.2.1方案1：

系统平稳后，进供试品溶液，基线平稳时间约在65min，谱图如下：

3.2.2方案2：继续调整比例，看是否还能缩短分析时间，如下：

系统平稳后，进供试品溶液，基线平稳时间约在55min，谱图如下：

再进系统配制溶液，基线平稳时间约在65min，且谷高比符合要求，得谱图如下：

3.2.3小结：从上面分析可以看出，方案2可以使系统配制溶液基线平稳的时间由110min降到70min，供试品头孢曲松钠基线平稳的时间由85min降到55min，平均减少了35min，即节约了流动相，又减少了样品的分析时间，因此头孢曲松钠聚合检测时可以选择方案2的梯度洗脱方法。

结论：
通过3.1和3.2两个部分来看，使用高效液相色谱仪和高压填装不锈钢葡聚糖凝胶色谱柱能够满足头孢曲松钠聚合物的检测，并通过调整流动相比例在得到有效谱图的同时可以节约分析时间。因此，可以判断此方法能够满足头孢曲松钠聚合物检测的系统适应性要求，且能节约样品分析时间，而此过程所涉及的仪器设备可以通过国外认证机构的认可。因此，头孢曲松钠聚合物检测可以舍弃原来实验室自己组装的高分子杂质仪，而采用高效液相色谱仪（如agilent1100型）进行测定。

参考文献：
1. 2010版《中国药典》二部第182页
2. 2005年版《中国药品检验标准操作规范与药品检验仪器操作规程》第93页—101页、第28页—131页

备注：具体的投稿内容在形式上和具体内容上会和这个帖子稍微有些不同，如果需要，我会在文章发表后上传!

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2010/8/12 12:19:43 Last edit by luxw