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主题：【第三届原创大赛】氨基酸衍生后样品溶液溶剂效应问题

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wumingpu
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发表于：2010/12/03 15:56:39 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
按照Agela氨基酸方法包中18中氨基酸检测方法检测18中氨基酸标准品。
方法操作：

各种溶液的配制：

1）    三乙胺乙腈溶液：取三乙胺一瓶，加乙腈8.6ml，混匀。

2）    异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异亮氰酸苯脂1瓶，加乙腈2ml，混匀。

3）    流动相A：称取15.2g醋酸钠，加水1850ml，溶解后用冰醋酸调pH至6.5，然后加入乙腈140ml，混匀，用0.45um滤膜过滤。

    流动相B：80%乙腈

4）    正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸约10mg，加0.1mol/L 盐酸溶液10ml 溶解，混匀。



  氨基酸标准溶液的衍生：准确量取氨基酸标准溶液200ul，置于1ml离心管中，往离心管中准确加入正亮氨酸内标溶液20ul，然后往离心管中 加入三乙胺乙腈溶液100ul，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100ul，混匀，室温放置1小时，然后加入正己烷400ul，振摇后放置10分钟，取下层溶液（PTC-AA），用0.45um针头滤器过滤。


实验条件：

色谱柱：    Venusil-AA，5μm，100A，4.6x250mm

柱温：      44℃

流速：      1.0ml/min

进样量：    2μL

检测波长：  254nm

实验室温度： 22-25℃

梯度条件：

时间（min）0215253333.13838.145
B（%）0010304510010000

下面是进样后的色谱图，结果令我们很吃惊，5min之前景然出现了三个峰，整个样品做完发现多出来一种氨基酸，重新衍生样品后也是类似情况，于是打电话给Agela售后工程师询问方法包中到底有多少种氨基酸，工程师告诉我们是17种(加上正亮氨酸内标后为18种），于是我们向他们请教我们遇到的问题，也把图给他们看了（图1），工程师看了图后第一句话就告诉我们是因为样品溶液溶剂效应引起的，我们都很不理解，我们进样才2ul怎么会产生溶剂效应呢？后来工程师告诉我们一个简单的方法，就是将衍生好待进样的样品用水稀释5倍，进样10ul（图2），我们照做了，结果十分吃惊啊！峰型很完美！  very  beautiful！

下面是衍生好进样2ul的样品图：

                                                                                              图1
将衍生后待进样的样品用水稀释5倍进样10ul样品图：

                                                                                              图2
原来样品溶液的溶剂效应对分析结果的影响这么大，这下算是切身体会到了。十分感谢Agela工程师的帮助！！
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jianzhu_zhang
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2010/12/3 23:23:00 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
支持！顶一个！感谢楼主与我们分享
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misstang
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2010/12/4 16:39:09 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
溶剂效应具体的成因是什么呢，是因为样品没有被完全溶解吗
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lxqmsq
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2010/12/4 16:50:02 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我用过agela的柱子，性能还是很好的。特意支持一下，希望能帮助更多的用户。如果买的多给打折多点，送点礼品就好了啊！！！！
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spoken2008
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2010/12/4 17:22:24 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
顺便问下，D型和L型脯氨酸可以用这个方法分开吗？
谢谢
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lousha
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2010/12/5 15:37:15 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 misstang(misstang) 发表:
溶剂效应具体的成因是什么呢，是因为样品没有被完全溶解吗


如图，强溶剂会影响样品起始谱带。

  绿色为溶剂，红色为样品



其实是样品，样品溶剂，流动相和固定相综合作用的关系．当样品在样品溶剂中的相对溶解度大于在流动相时（可以理解为样品溶剂的洗脱能力大于流动相），样品就更喜欢在样品溶剂中，并很想随之流动．但同时与固定相的强作用只能使之形成追赶样品溶剂的效果．最终导致前延峰或裂峰的出现．（如图２：高溶解性溶剂）．但当样品与固定相作用很弱时，大部分样品可能会赶上样品溶剂，但又由于与固定相的弱作用，导致其不可能与样品溶剂同时流出，最终导致拖尾峰的出现．

这也就是为什么在一般反相色谱中要用低有机相（比流动相低）溶解样品的原因！其效果就如图１：低溶解性溶剂

溶剂效应通常对出峰时间早的组份影响明显（tR<5'）

引用申明：回答图片和文字均来自另一网站，非lousha原创。除了“溶剂效应通常对出峰时间早的组份影响明显（tR<5'）”这句话出自lousha本人。
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2010/12/5 15:38:02 Last edit by lousha
mrzhanglijun
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2010/12/7 21:52:47 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
谢谢分析，我也有过类似的经历
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wumingpu
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2010/12/8 10:11:00 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
最近又在做了，很顺利！
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tianhaikuo
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2010/12/9 11:39:24 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
谢谢楼主的分享，让我也受益匪浅！
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tracy2010
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2010/12/10 13:32:45 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
老师有课题在做饲料氨基酸分析，最近在找方法头疼死了，老师还一直催，愁死了都，竟然让我发现这文章，哈哈哈，非常感谢楼主的分享
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cuijinsong1987
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2011/1/14 0:35:42 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 spoken2008(spoken2008) 发表:
顺便问下，D型和L型脯氨酸可以用这个方法分开吗？
谢谢

这个听说有个PC色谱柱能做，不知道是哪个厂家的。我是听检科院的人说的，他们还给我们发过资料。
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