“色”路蹒跚,不拘一格,头孢呋辛酯干混悬剂有关物质流动相摸索部分。
我主要工作是仿6,在遇到国家标准,我一般持研究态度,因为仿制药提倡的是仿制其质量而不是标准,一般会进行些比较。
例如该品种在中国药典2010年班二部有收载,用的是等度洗脱方式,在进行研究的时候,发现梯度洗脱更具优势,所以就改变了系统方式。
其具体研究方式如下:
6.4 有关物质
6.4.1方法的选择参照中国药典2005年版二部收载的头孢呋辛酯原料药质量标准、美国药典USP32-NF27收载的头孢呋辛酯混悬剂质量标准和新药转正标准第60册收载的头孢呋辛酯干混悬剂质量标准WS1-(X-391)-2004Z有关物质检查项,本品选择高效液相色谱法作为有关物质检测方法。6.4.2方法学验证
6.4.2.1 试验材料仪器:LC-10AT、20AT VP泵(SHIMADZU CORPORATION)SPD-10A、20A、M20A VP紫外检测器(SHIMADZUCORPORATION)工作站:LC solution(SHIMADZU CORPORATION) 色谱柱:C18色谱柱,粒度5um,规格250mm×4.6mm,wel518425,LN:W1801.19,SN:1021096.主要试剂:甲醇(色谱纯)、磷酸二氢铵(分析纯)、6.4.2.2 波长选择根据专属性试验结果并参照中国药典2010年版(二部)收载的头孢呋辛酯原料药质量标准、美国药典USP32-NF27收载的头孢呋辛酯混悬剂质量标准和新药转正标准第60册收载的头孢呋辛酯干混悬剂质量标准WS1-(X-391)-2004Z有关物质检查项,本品选择高效液相色谱法作为有关物质检测方法。波长选择为278nm。6.4.2.3 流动相选择参照中国药典2010年版(二部)收载的头孢呋辛酯原料药质量标准、美国药典USP32-NF27收载的头孢呋辛酯混悬剂质量标准和新药转正标准第60册收载的头孢呋辛酯干混悬剂质量标准WS1-(X-391)-2004Z有关物质检查项色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流速为每分钟1.0ml,检测波长278nm,进样量20μl。6.4.2.3.1 等度洗脱流动相配制:①0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇(60:40);②0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇(50:50);③0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇(55:45)。供试样品配制:称取头孢呋辛酯对照品适量(约相当于头孢呋辛11mg),置20ml量瓶中,加2ml甲醇超声溶解,分别用相应的流动相稀释至刻度,摇匀,滤过,精密量取20μl注入液相色谱仪并记录色谱图。试验结果见表10-6,色谱图见图37~39。表10-6等度洗脱试验结果
流动相 | 异构体 | 保留时间 (min.) | 拖尾因子 | 与相邻峰 分离度 | 理论板数 | 出峰个数 |
① | 异构体B | 15.757 | 0.992 | 2.189 | 4871 | 11 |
异构体A | 18.688 | 0.967 | 3.030 | 5249 |
△3-异构体 | 21.285 | 0.984 | 1.939 | 2671 |
② | 异构体B | 4.952 | 1.063 | 1.448 | 3808 | 13 |
异构体A | 5.446 | 1.019 | 1.482 | 3994 |
△3-异构体 | 5.903 | - | 0.419 | 165 |
③ | 异构体B | 8.094 | 1.011 | 13.739 | 4361 | 9 |
异构体A | 9.247 | 0.990 | 2.239 | 4690 |
△3-异构体 | 10.314 | 1.104 | 1.579 | 2590 |
试验结果表明流动相①、流动相③分离度大于1.5,较流动相②好;流动相①洗脱出峰个数较流动相③多2个;流动相①、流动相③异构体出峰时间较较流动相②理想。综上初步拟订以流动相①0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇(60:40)为有关物质检查的流动相。典型色谱图:
6.4.2.3.2 梯度洗脱由于本品为头孢类抗生素,杂质个数可能较多,初步拟选用梯度洗脱方式对本品有关物质进行探索研究。流动相配制:流动相A: 0.2mol/L磷酸二氢铵溶液,流动相B:甲醇。根据6.4.2.3.1 等度洗脱试验结果,拟定梯度洗脱流动相A、B初始浓度比例60:40,由于异构体A、B出峰时间约为20分钟,△3-异构体分离度分离度较小,在梯度洗脱流动相A、B初始浓度比例60:40保持在20分钟以后进行比例变化,梯度洗脱程序见表10-7。表10-7 梯度洗脱程序
梯度 | 时间(min.) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
① | 0 | 60 | 40 |
35 | 60 | 40 |
40 | 40 | 60 |
45 | 60 | 40 |
60 | 60 | 40 |
② | 0 | 60 | 40 |
20 | 60 | 40 |
40 | 40 | 60 |
45 | 60 | 40 |
60 | 60 | 40 |
供试液配制:溶剂:0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇(60:40)①称取头孢呋辛酯对照品0.0124g,置20ml量瓶中,加2ml甲醇超声溶解,用溶剂稀释至刻度,摇匀,滤过,精密量取20μl注入液相色谱仪,以梯度①进行洗脱并记录色谱图。②称取头孢呋辛酯对照品0.0127g,置20ml量瓶中,加2ml甲醇超声溶解,用溶剂稀释至刻度,摇匀,滤过,精密量取20μl注入液相色谱仪,以梯度②进行洗脱并记录色谱图。③称取本品(规格:0125g,批号:20100301)经紫外光照射24h细粉0.0391g,置20ml量瓶中,加2ml甲醇超声溶解,用溶剂稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为系统适应性溶液,精密量取20μl注入液相色谱仪,以梯度②进行洗脱并记录色谱图。④称取头孢呋辛酯对照品0.00470g,置20ml量瓶中,加2ml甲醇超声溶解,用溶剂稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液水浴60℃加热1h,放冷,作为系统适应性溶液,精密量取20μl注入液相色谱仪,以梯度②进行洗脱并记录色谱图。试验结果见表10-8,色谱图见图40~46。表10-8梯度洗脱试验结果
供试液 | 异构体 | 保留时间 (min.) | 拖尾因子 | 与相邻峰 分离度 | 理论板数 | 出峰个数 |
① | 异构体B | 14.421 | 1.000 | 2.213 | 4841 | 14 |
异构体A | 16.995 | 0.975 | 2.917 | 5281 |
△3-异构体 | 19.327 | 1.024 | 1.890 | 2544 |
② | 异构体B | 14.376 | 1.001 | 2.152 | 4838 | 19 |
异构体A | 16.944 | 0.975 | 2.912 | 5237 |
△3-异构体 | 19.296 | 0.999 | 1.879 | 2428 |
③ | 异构体B | 14.413 | 1.001 | 4.698 | 4842 | 18 |
异构体A | 16.984 | 0.978 | 2.915 | 5274 |
△3-异构体 | 19.346 | 0.977 | 1.854 | 2301 |
④ | 异构体B | 14.236 | 1.025 | 2.044 | 4880 | 21 |
异构体A | 16.742 | 1.011 | 2.895 | 5342 |
△3-异构体 | 19.057 | 1.003 | 1.843 | 2282 |
试验结果表明梯度①基线较梯度②漂移幅度大;梯度①在30分钟和50分钟时间处洗脱出的杂质分离度较梯度②差;梯度①较梯度②洗脱出的杂质个数少5个;紫外破坏和高温破坏系统适应性溶液均能符合要求。综上初步拟订以流动相A: 0.2mol/L磷酸二氢铵溶液,流动相B:甲醇以梯度②进行有关物质检查。6.4.2.4初步拟定有关物质检查方法参照中国药典2005年版二部收载的头孢呋辛酯原料药质量标准、美国药典USP32-NF27收载的头孢呋辛酯混悬剂质量标准和新药转正标准第60册收载的头孢呋辛酯干混悬剂质量标准WS1-(X-391)-2004Z有关物质检查项,初步拟定有关物质检查方法如下:取本品细粉适量,精密称定(约相当于头孢呋辛50mg),置100ml量瓶中,加甲醇10ml溶解,再用流动相稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液;精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录Ⅴ D)测定,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.2mol/L磷酸二氢铵溶液为流动相A,以甲醇为流动相B,按下表进行线性梯度洗脱,检测波长为278nm,流速为每分钟1.0ml。取对照溶液20μl注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使两主成分中任一主成分色谱峰的峰高为满量程的20%~25%。取头孢呋辛酯对照品适量,加甲醇溶解,用流动相稀释制成每1ml中约含头孢呋辛0.2mg的溶液,摇匀,量取适量,于60℃水浴中加热至少1小时,放冷至室温,得含△3-异构体溶液;取经紫外光照射24小时的本品适量,精密称定,加甲醇适量溶解,用流动相稀释制成每1ml中约含头孢呋辛0.2mg的溶液,作为含头孢呋辛酯E异构体的溶液。分别取上述溶液20μl,分别注入液相色谱仪,头孢呋辛酯A、B异构体、△3-异构体及E异构体峰的相对保留时间分别约为1.0、0.9、1.2及1.7和2.1,头孢呋辛酯A、B异构体之间、头孢呋辛酯△3-异构体之间的分离度均应符合要求。立即精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl,分别注入液相色谱仪。供试品溶液色谱图中如有杂质峰,两个E异构体峰面积之和不得大于对照溶液两个主峰面积之和的1.5倍(1.5%),Δ3-异构体峰面积不得大于对照溶液两个主峰面积之和的2倍(2.0%),其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液两个主峰面积之和(1.0%),各杂质峰面积的和不得大于对照溶液两个主峰面积之和的4.5倍(4.5%)(供试品溶液中任何小于对照溶液两个主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计)。线性梯度洗脱程序
时间(min.) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 60 | 40 |
20 | 60 | 40 |
40 | 40 | 60 |
45 | 60 | 40 |
60 | 60 | 40 |
结语:从以上典型色谱图,不言而喻了。我的观点就是能最大限度检出杂质个数,以及满足分离度的要求。结合这些条件并对上市品做一个综合的评价就可以了,鉴于实验室条件,也只能进行峰纯度鉴别。本品的主题就是不要拘泥现在的标准,要敢于创新。