主题：【第六届原创】酒中抗氧化能力ORAC分析

浏览0 回复16 电梯直达

huangza

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

药物分析发表于：2013/10/14 16:31:38 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

维权声明：本文为huangza原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

酒中抗氧化能力ORAC分析

1.实验原理

ORAC反应是一个经典的氢原子转移(HAT)的氧化过程。在实验条件下，一分子的AAPH失去一分子氮气，生成两分子AAPH自由基(方程1)。在空气中，生成的AAPH自由基很快与O2反应(方程2)生成相对稳定的过氧自由基ROO· 。荧光素的荧光衰退曲线表明过氧自由基对荧光素的破坏程度，在没有抗氧化剂存在的情况下，ROO·从FL获得一个氢原子(方程3)，致使荧光素的荧光衰退；在有抗氧化剂(ArOH)存在的情况下，ROO·从抗氧化剂获得一个氢原子，生成ROOH和一个稳定的抗氧化剂自由基ArO· (方程4)，致使荧光素被过氧自由基破坏的速率受到抑制(见图1)。
R－N＝N－R 2R· + N2 (1)
R·+O2 ROO· (2)
ROO· + probe (荧光素) ROOH + oxidized probe (失去荧光) (3)
ROO·+ArOH（抗氧化剂） ArO· + ROOH (4)

图1 ORAC检测示意图

2.实验方法

ORAC法即氧自由基吸收能力（又称为抗氧化能力指数），是一种测量不同食品抗氧化能力的国际通用标准单位，检测数值愈高代表其抗氧化能力就愈强。ORAC法适合抗氧化剂的高通量筛选，是目前评价抗氧化物质抗氧化活性的最为准确、灵敏度高、应用范围广的方法之一，目前国际上已经有很多商品的标签注明抗氧化能力（ORAC值）。

将空白、样品以及标准抗氧化物(Trolox)各20μL，分别与160μL荧光素溶液混合后37℃保温30min，然后再加入AAPH溶液20μL，迅速开始测定，利用荧光酶标仪配备软件记录荧光强度，初始荧光强度值记为f0，以后每隔一段时间测定一个点，荧光强度分别记为f1, f2 …，抗氧化剂作用下荧光衰减曲线下的积分面积，扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积，得出抗氧化剂的曲线下净面积(Net AUC)。抗氧化剂的ORAC值是通过其荧光衰退曲线的曲线下净面积与标准抗氧化物质Trolox的曲线下净面积相比得出的，ORAC值以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g (μmol TE/g)或μmol Trolox equivalent/L (μmol TE/L)表达。

我们将以ORAC方法来验证，包括线性（定量限与检测限）、精密度与准确度、重复性与稳定性、回收率等。通过验证方法的可行性，以此来评价保健酒的抗氧化能力。

3.试剂溶液的制备

3.1磷酸盐缓冲溶液

3.1.1缓冲溶液储备液

0.75 M K₂HPO₄：130 g K₂HPO₄溶于1 LddH₂O；

0.75 M NaH₂PO₄：90 g NaH₂PO₄溶于1 LddH₂O

3.1.2缓冲溶液工作液

分别量取K₂HPO₄贮备液81 mL，NaH₂PO₄贮备液19 mL，混合后用ddH₂O定容至1000 mL，这样得到75 mM，pH 7.4的缓冲溶液，冰箱下贮存。

3.2荧光素钠盐溶液

荧光素钠盐贮备液1：称取0.0456g荧光素钠盐定容到100 mL磷酸缓冲液，4℃黑暗贮存；

荧光素钠盐贮备液2：1000μL贮备液1用磷酸缓冲液定容至100mL，4℃黑暗贮存；

荧光素钠盐工作液：800μL贮备液2用磷酸缓冲液定容至100mL，4℃黑暗贮存。

3.3 Trolox标准溶液的配制

0.0125 g Trolox定容到50 ml磷酸缓冲液中，得到1000μM的贮备液，−20℃ 贮存。然后用磷酸缓冲溶液依次稀释成100，50，25，12.5，6.25μM的工作液。

3.4 AAPH溶液

0.414g AAPH完全溶于10mL pH7.4，75mM的磷酸缓冲溶液，即得153mM的溶液，冰浴保存。（8h的有效期，现配现用）

3.5 Uric acid溶液

称量0.01681g Uric acid定容至100 mL磷酸缓冲液中，再依次稀释，得到20、40、60、80μM的工作液。

3.6 Caffic acid溶液

称量0.02252g Caffic acid定容至100 mL磷酸缓冲液中，再稀释得到12.5μM的工作液。

4.数据处理

下图是各浓度梯度的Trolox标准溶液，以及没有添加自由基的FL荧光自然衰减对照(AAPH阴性对照)和没有抗氧化剂存在时的自由基作用对照(Blank)的荧光衰退曲线图如图2所示：

图2 荧光衰退曲线图

各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据与AAPH阴性对照空白荧光强度相比，折算成相对荧光强度f，以相对荧光强度采用近似积分法计算荧光熄灭曲线下面积(AUC)。通过每隔2分钟测定一次，连续测定2个小时得到的动力学图如图3：

图3 荧光强度动力学图

因此荧光衰退曲线下面积AUC可以近似看作各梯形面积之和，可以表达为：

AUC=0.5×(f₀/f₀+f₁/f₀)×ΔT+0.5×(f₁/f₀+f₂/f₀)×ΔT+...+0.5×(f_x/f₀+f_x+1/f₀)×ΔT+...+0.5×(f_n-1/f₀+f_n/f₀)×ΔT

=0.5×[2×(f₀/f₀+f₁/f₀+...+ f_n-1/f₀+f_n/f₀)-f₀/f₀-f_n/f₀]×ΔT

其中f_n代表第n个测定点时的荧光强度， ΔT为相邻两个测定点之间的时间间隔，因本实验室ORAC测定方法中ΔT设定为2min，一共有61测定点，因此该公式可以简化为：

AUC=2×(f₁/f₀+...+f₆₀/f₀+f₆₁/f₀)-f₆₁/f₀+1

Trolox标准溶液曲线下净面积Net AUC的计算公式是：Net AUC = AUC_Trolox− AUC_blank ，通过以曲线下净面积Net AUC与浓度绘制Trolox的标准曲线（图4），得出标准方程Y=A+BX（X：Net AUC，Y：浓度）。

图4 Trolox标准曲线图

样品曲线下净面积Net AUC的计算公式是：Net AUC = AUC样品 − AUCblank ，计算样品的曲线下净面积Net AUC，将样品的Net AUC值带入Trolox的标准曲线即得浓度，再换算出最终浓度，即为以ORAC值，ORAC值以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g (μmol TE/g)或μmol Trolox equivalent/L (μmol TE/L)表达。

5.方法学研究

5.1 线性、定量限与检测限

使用0、6.25、12.5、25、50、100μM的Trolox标准溶液进行试验，重复测量6次，绘制标准曲线，试验表明不同浓度的Trolox与Net AUC(曲线下净面积)相关系数都在0.99以上（见表1），曲线斜率平均值2.398±0.0765，说明不同浓度的Trolox与其Net AUC具有线性关系。

表1 Trolox标准曲线线性

次数	1	2	3	4	5	6	平均值	SD	%RSD
斜率	2.3496	2.3517	2.367	2.3298	2.48	2.5097	2.398	0.0765	3.1923
相关系数	0.9994	0.9989	0.9983	0.9974	0.9979	0.9987	0.9984	0.0007	0.0721

检测限（LOD）是以3倍空白测得值的标准偏差除以校正曲线的斜率来计算，因此方法的检测限是1μM—3μM。

5.2精密度与准确度

使用20、40、60、80μM 4个不同浓度的尿酸测定6次，计算标准偏差SD、相对标准偏差%RSD、准确度，如表2：

表2 质控样（尿酸）的准确度与精密度

		20μM	40μM	60μM	80μM
1	平均值	18.22	39.32	60.09	81.55
	SD	1.44	0.83	0.54	1.23
	%RSD	7.92	2.11	0.91	1.51
	准确度%	91.12	98.31	100.15	101.93
	n	3	3	3	3
2	平均值	20.72	41.67	62.76	81.14
	SD	0.80	0.59	0.23	3.09
	%RSD	3.86	1.41	0.36	3.81
	准确度%	103.58	104.18	104.61	101.42
	n	3	3	3	3
3	平均值	19.71	41.31	60.99	83.62
	SD	0.61	0.50	2.70	0.23
	%RSD	3.11	1.20	4.42	0.28
	准确度%	98.55	103.28	101.65	104.53
	n	3	3	3	3
4	平均值	20.37	42.19	63.07	82.96
	SD	0.59	0.19	0.080	0.25
	%RSD	2.92	0.44	0.13	0.30
	准确度%	101.83	105.49	105.11	103.70
	n	3	3	3	3
5	平均值	19.69	41.08	63.04	84.10
	SD	0.56	0.39	0.27	0.28
	%RSD	2.86	0.94	0.44	0.33
	准确度%	98.45	102.70	105.07	105.13
	n	3	3	3	3
6	平均值	18.76	40.85	61.21	83.19
	SD	1.17	0.18	1.51	0.16
	%RSD	6.26	0.44	2.47	0.20
	准确度%	93.79	102.13	102.02	103.99
	n	3	3	3	3
总体	平均值	19.58	41.07	61.86	82.76
	SD	0.86	0.45	0.89	0.87
	%RSD	4.49	1.09	1.46	1.07
	准确度%	97.89	102.68	103.10	103.45

从上表看出，4个不同浓度的尿酸，每次测量的准确度在91%-106%之间，总体上的准确度在97%-104%之间，而相对标准偏差%RSD都小于10%，说明方法测定的精密度与准确度都较好。

5.3稳定性

使用Caffic acid（12.5μM）测定9天，Net AUC(曲线下净面积)与天数的曲线图5：

图5 ORAC方法的稳定性

通过实验表明，测定的Net AUC(曲线下净面积)有一定的波动，总体上ORAC方法测定的稳定性好。

5.4回收率

选定一个酒体稀释梯度样品（1：80，批号2010060202），准确测定其浓度值为53.677μM。在10mL的容量瓶中分别加入400μL、500μL、600μL 1000μM的Trolox标准溶液，然后用其稀释梯度样品定容至10mL（即相当于分别加入40、50、60μM的Trolox标准溶液），测定各自的结果，如下表3：

表3 回收率试验

	测得值μM	实际值μM	回收率%
1	95.461	93.677	98.1312
2	101.647	103.677	101.997
3	107.917	113.677	105.337

结果表明，三个回收率分别为98.13%、102.00%、105.34%，说明此方法符合检测要求，适用于酒中的ORAC值的测定。

6.某酒体样品ORAC值的测定

选择三个酒体样品进行ORAC值的测定，结果如下表4：

样品批号：1# 2010060202 2# 2010060302 3# 2010060947单位均为μmol TE/L

表4 酒体样品ORAC

编号	1			2			3			平均
编号	ORAC	SD	%CV	ORAC	SD	%CV	ORAC	SD	%CV	ORAC	SD	%CV
1#	5034.9	232.71	4.62	5116.2	391.32	7.65	4983.8	829.33	16.64	5045	484.45	9.64
2#	4557.8	107.2	2.35	4633.1	273.27	5.9	5028	800.09	15.91	4739.6	393.52	8.05
3#	5037	216.65	4.3	4924.6	228.85	4.65	5181.8	504.96	11.92	5047.8	316.82	6.96

1#样ORAC平均值为5045 μmol TE/L，2#样ORAC平均值为4739.6 μmol TE/L，3#样ORAC平均值为5047.8 μmol TE/L。

7.小结

从以上各项数据表明，该检测方法具有良好的精密度、准确度、稳定性，回收率在98%—106%之间，因此该方法适合样品中ORAC值的检测。

通过在试验中不断摸索，总结出以下在检测ORAC过程中要注意的事项：

① 由于AAPH自发分解产生自由基的速率主要取决于温度，而且活性非常强，因此AAPH溶液必须现用现配，配好的溶液要放在冰浴中保存，以免失效。另外在加入AAPH前微孔板要放在37℃保温30min，加入AAPH最好在1min内完成，这样可以减小试验误差；

② 因为荧光素钠盐的荧光强度对反应体系的PH值比较敏感，当pH低于7.0时，其荧光强度显著降低，因此所有试剂溶液都要以缓冲溶液配制，从而消除样品pH值对荧光素钠盐荧光强度的影响；

③ ORAC方法对温度非常敏感，整个微孔板控制相同的温度是最基本的，不同孔温度的变化都可能影响实验的重现性，因此为避免“边缘效应”，对于96孔板只选用里面的60孔进行实验；

④注意单位的换算，一般情况下液态样品用μmol TE/L，固态样品用μmol TE/g或μmol TE/100g表示；

8.参考文献

1. Dejian Huang, Boxin Ou, Maureen Hampsch-Woodill, Judith A. Flanagan, and Ronald L. Prior J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 4437–4444.

2. Ronald L. Prior, Ha Hoang, Liwei Gu, Xianli Wu, Mara Bacchiocca, Luke Howard, Maureen Hampsch-Woodill, Dejian Huang, Boxin Ou, and Robert Jacob J. Agric. Food Chem., 2003, 51 (11), 3273-3279.

3. Huang, D.; Ou, B.; Hampsch-Woodill, M.; Flanagan, J.; Deemer,E. J. Agric.Food Chem. 2002, 50, 1815-1821

http://www.nutraceuticalsworld.com/March042.htm

4. Ou, B.;Huang, D.; Hampsch-Woodill, M. Patent Application Publication. Feb.15,2007.

5. Lucas-Abellan C,Mercader-Ros M T,Zafrilla M P,et al. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 2254–2259

6. 续洁琨，姚新生，栗原博中国药理学通报 2006，22 (8)：1015-1021

7. 宋立霞，王向社，吴紫云，李明芳，刘兴地，郑学勤食品研究与开发 2008，29（12）：166-170

该帖子作者被版主 kather加 10积分， 2经验，加分理由：原创作品