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原文由 shanshunan(shanshunan) 发表:原文由 zhoujin83(zhoujin83) 发表:
检查一下样品性质吧。楼主的样品估计是弱酸性，而且其pKa应该为6左右。所以之前楼主的稀释剂pH=4，样品完全不电离，同时流动相因为没有缓冲盐，所以pH变化不大，样品进入流动相后仍然呈分子状态，就能得到一个很好的峰；而将稀释剂pH调到6后，样品在这个pH下有两种状态，即分子态和离子态，并将这种状态保持到流动相中，所以出现了这样的峰形。另外，由于楼主的样品是弱酸性的，其保留随流动相pH的变化情况是，流动相pH增大，保留减小，流动相pH减小，保留增大。如上所述，楼主的流动相没有缓冲能力，稀释剂pH增大后，流动相pH也相应增大，所以样品保留减小了。
谢谢的zhoujin83分析，样品性质确实如你所述，低pH值为分子态，升高pH值会逐渐向离子态变化。
再继续请教，我在升高pH值该如何进行HPLC方法条件的设置使之只出一个峰？或者在计算这种物质的峰面积时我能够把两个峰面积值加一下？谢谢！
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检查一下样品性质吧。楼主的样品估计是弱酸性，而且其pKa应该为6左右。所以之前楼主的稀释剂pH=4，样品完全不电离，同时流动相因为没有缓冲盐，所以pH变化不大，样品进入流动相后仍然呈分子状态，就能得到一个很好的峰；而将稀释剂pH调到6后，样品在这个pH下有两种状态，即分子态和离子态，并将这种状态保持到流动相中，所以出现了这样的峰形。另外，由于楼主的样品是弱酸性的，其保留随流动相pH的变化情况是，流动相pH增大，保留减小，流动相pH减小，保留增大。如上所述，楼主的流动相没有缓冲能力，稀释剂pH增大后，流动相pH也相应增大，所以样品保留减小了。
谢谢的zhoujin83分析，样品性质确实如你所述，低pH值为分子态，升高pH值会逐渐向离子态变化。
再继续请教，我在升高pH值该如何进行HPLC方法条件的设置使之只出一个峰？或者在计算这种物质的峰面积时我能够把两个峰面积值加一下？谢谢！
为什么一定要改变稀释剂呢，以前使用pH4.0的稀释剂有什么不好？我不建议使用pH6.0的稀释剂，因为这样样品在稀释剂中就有2种形态，不太好。如果你非要使用pH6.0的稀释剂，那么我会建议流动相的水相使用缓冲盐，并且pH调到4.0，但这样也不一定能解决你的问题。不到万不得已，一般不会计算纯度时将两个峰相加。
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检查一下样品性质吧。楼主的样品估计是弱酸性，而且其pKa应该为6左右。所以之前楼主的稀释剂pH=4，样品完全不电离，同时流动相因为没有缓冲盐，所以pH变化不大，样品进入流动相后仍然呈分子状态，就能得到一个很好的峰；而将稀释剂pH调到6后，样品在这个pH下有两种状态，即分子态和离子态，并将这种状态保持到流动相中，所以出现了这样的峰形。另外，由于楼主的样品是弱酸性的，其保留随流动相pH的变化情况是，流动相pH增大，保留减小，流动相pH减小，保留增大。如上所述，楼主的流动相没有缓冲能力，稀释剂pH增大后，流动相pH也相应增大，所以样品保留减小了。
谢谢的zhoujin83分析，样品性质确实如你所述，低pH值为分子态，升高pH值会逐渐向离子态变化。
再继续请教，我在升高pH值该如何进行HPLC方法条件的设置使之只出一个峰？或者在计算这种物质的峰面积时我能够把两个峰面积值加一下？谢谢！
为什么一定要改变稀释剂呢，以前使用pH4.0的稀释剂有什么不好？我不建议使用pH6.0的稀释剂，因为这样样品在稀释剂中就有2种形态，不太好。如果你非要使用pH6.0的稀释剂，那么我会建议流动相的水相使用缓冲盐，并且pH调到4.0，但这样也不一定能解决你的问题。不到万不得已，一般不会计算纯度时将两个峰相加。
谢谢您的宝贵意见，因为我想究这种物质在不同pH值下反应时的浓度变化。
如果允许的话，还是建议使用pH4.0或3.0的流动相，这样保留时间大约为10min，
PS：我想到了一个办法，虽然在pH=6时有两种状态，但样品浓度不变（C总=C分子+C离子），我可以在进样时，把样品调回到pH=4再进行测试，这个应该可行吧。
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